肝细胞癌中外泌体ncRNAs的研究进展

招文婷，文 彬，孙嘉玲，杨雪梅，陈炜聪，孙海涛，贺松其

(1.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；2.中国人民解放军四五八医院中医科，广东 广州 510602)

全世界大约75%～85%的肝癌是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，HCC是全球第六大最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的第四大常见原因。HCC在我国恶性肿瘤的发病率和病死率分别为第4位和第3位，其预后差且复发风险高[1]。目前，HCC的诊断手段较局限，易遗漏早期小肿瘤；而HCC的传统治疗方法，疗效欠佳。因此，HCC患者需要有效的诊治及监测肿瘤进展的方法。近年来，研究发现外泌体在各种癌症，尤其是HCC中，发挥着重要的生物学功能。肿瘤微环境是HCC的重要组成部分，外泌体作为一种膜结合载体，可被受体细胞吸收，在HCC肿瘤微环境中发挥细胞通讯作用，从而调控HCC的发生发展。

1 外泌体ncRNAs的生物学特性

外泌体是由活细胞释放的直径为30～100 nm的膜状细胞外囊泡，存在于血液、尿液和唾液等各种体液中，其内含核酸、蛋白质和脂质等生物活性分子[2]。外泌体可通过细胞间直接接触、质膜融合或受体介导的内吞作用等方式，发挥细胞通讯作用，将核酸等生物活性成分传递到受体细胞中，调节受体细胞的行为，发挥生物学功能。外泌体中的非编码RNA(no coding RNA,ncRNA)是一类没有蛋白编码能力的RNA，如微小RNA(micro RNA，miRNA)，长链非编码RNA(long no coding RNA，lncRNA)，环状RNA(circular RNA，circRNA)。ncRNAs通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用，可以调节基因的转录表达，转录后表观遗传水平和调节细胞进程。其中，miRNA是由20～24个核苷酸RNA组成的小RNA，成熟的miRNA通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)结合，从而在转录后水平调控靶基因的表达，进而导致mRNA降解或靶mRNA的翻译抑制[3]。lncRNA是一类分子大于200 bp的转录物，通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用，参与肿瘤的发生发展等一系列生物学过程。circRNA与线性RNA不同，是无5′帽和3′尾多腺苷酸化特殊的共价闭合连续环，这种结构使得其较线性mRNA对RNA酶具有更高的耐受力，可充当miRNA的海绵体起到调节基因表达的作用，是肿瘤发生发展的关键因子[4]。

2 外泌体ncRNAs调节肿瘤微环境，促进HCC进展

肿瘤微环境由肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞等细胞成分，以及细胞外基质、生长因子、炎性细胞因子、蛋白水解酶和其抑制剂等非细胞成分组成[5]。肿瘤细胞的恶性行为不仅取决于自身，还受到肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用的调节，外泌体可发挥其细胞间通讯作用，充当肿瘤微环境中细胞间通讯的关键介质，介导肿瘤细胞与其微环境之间相互作用。越来越多的研究发现，ncRNAs作为外泌体内重要的生物活性分子，可有效调控HCC肿瘤微环境，包括参与HCC肿瘤生长、促进肿瘤侵袭转移、诱导血管形成、调节免疫反应等过程，从而影响HCC发生发展进程。

2.1 外泌体ncRNAs促进HCC生长既往对细胞间通讯的研究主要是聚焦在信号蛋白分子，但目前核酸分子作为细胞间的信使被越来越多的关注。然而RNA释放在细胞外容易被RNA酶降解，因此，外泌体作为RNA的转运载体，可有效防止RNA降解，更好发挥细胞间通讯作用。肿瘤细胞在进化过程中通过外泌体将致癌的ncRNAs转移至受体细胞，稳定传递生物信号，促进肿瘤生长。来自人肝星状细胞LX2的外泌体过表达的miR-335-5p可被受体HCC细胞吸收，在体外抑制HCC细胞增殖并抑制体内肿瘤生长；但进一步的研究发现，当LX2分别与4种HCC细胞系(MHCC97L，MHCC97H，Huh7和HepG2细胞)中的任何一种共培养时，观察到这些成纤维细胞以及HCC细胞中miR-335-5p的下调，从而促进HCC的增殖和生长[6]。此外，对来自HCC患者的癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)和相应的癌旁成纤维细胞的外泌体进行miRNA测序，发现CAF衍生的外泌体中miR-320a水平显著降低，体内外研究表明，miR-320a可通过直接与下游靶标PBX3结合，上调细胞周期蛋白依赖性激酶2，从而抑制HCC细胞增殖生长[7]。Zhang等[8]发现，脂肪细胞分泌的circRNA可调节HCC中的去泛素化，从而促进HCC细胞生长。研究发现，外泌体与泛素化相关的环状RNA circ-DB在体脂高的HCC患者上调，circ-DB通过抑制miR-34a并激活与去泛素化相关的USP7 / Cyclin A2信号通路促进肝癌细胞生长，减少DNA损伤。这些研究结果表明，外泌体ncRNAs可通过细胞通讯作用促进HCC细胞的生长。

2.2 外泌体ncRNAs促进HCC转移HCC转移是HCC发展进程中的重要环节，外泌体ncRNAs可通过介导上皮间质转化、细胞外基质降解和血管渗漏等生物过程促进HCC侵袭转移。外泌体ncRNAs可介导HCC细胞上皮间质转化，即使肿瘤细胞失去上皮表型获得间质表型，导致细胞间粘附减少，运动性增强，最终引起肿瘤侵袭转移。lncRNA FAL1在HCC来源的外泌体中上调，而lncRNA FAL1可以充当miR-1236的海绵体，增加EMT中的关键转录因子ZEB1的表达，促进HCC转移[9]。Han等[10]发现外泌体的关键调节因子Vps4A在HCC组织中经常被下调，而Vps4A可促进细胞内抑制肿瘤的miRNA的积累和摄取。进一步研究发现，Vps4A通过与CHMP4B和β-连环蛋白的相互作用，促进β-连环蛋白的质膜定位和外泌体释放，降低β-catenin在细胞核内的表达，抑制HCC细胞上皮间质转化。Zhang等[7]发现，miR-320a过表达可降低PBX3和磷酸化ERK1/2的水平，并同时增强E-钙粘蛋白的表达和降低N-钙粘蛋白的表达，而HCC患者中CAFs衍生的外泌体中miR-320a水平显著降低，最终通过以上机制促进HCC上皮间质转化。高转移特性的肝癌细胞LM3细胞衍生的外泌体传递circPTGR1，通过circPTGR1-miR449a-MET途径增强HepG2细胞(非转移性细胞系)和97 L细胞(低转移细胞系)迁移和侵袭能力[11]。

外泌体可以通过介导细胞外基质的降解，最终促进HCC侵袭转移。高度转移性HCC细胞系的外泌体中内含met、caveolin和S100等蛋白质，通过共培养，正常肝细胞系MIHC摄入外泌体后，增强了MIHC的迁移和侵袭潜能，并且发现MIHC细胞内Akt，磷酸化的MEK1/2和金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表达亦显著增加[12]。肿瘤转移的发生需要肿瘤细胞穿越内皮屏障，从血管渗漏，进入循环系统，到达靶器官中生长。外泌体ncRNAs可通过靶向调节基因表达，破坏内皮完整，促进肿瘤细胞穿越内皮屏障。Fang等[13]用来自表达稳定miR-103的HCC细胞的外泌体预处理内皮单层细胞，最终促进了肿瘤细胞的跨内皮侵袭，并且通过抑制内皮细胞中的miR-103消除了外泌体的这种作用，进一步研究发现肝癌细胞分泌的外泌体miR-103通过靶向调节VE-钙黏蛋白，p120-连环蛋白和闭锁小带1来破坏内皮细胞结合的完整性，削弱血管屏障，促进HCC细胞的跨内皮侵袭，从而促进HCC侵袭转移。

2.3 外泌体ncRNAs促进HCC血管生成血管生成可为肿瘤细胞提供足够的营养和氧气，是肿瘤生长和转移的关键步骤。HCC或CAFs衍生的外泌体ncRNAs可释放血管内皮生长因子(VEGF)等可溶性因子促进血管生成，为HCC提供充足的营养，促进其发生发展。研究表明癌症干细胞样CD90+肝癌细胞衍生的外泌体表达高水平的lncRNA H19，可显著增加VEGF的释放和VEGF-R1的产生，促进血管生成，lncRNA H19沉默后，VEGF蛋白的表达水平明显降低[14]。肿瘤来源的外泌体miRNA-21可以通过下调磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologous，PTEN)，将肝星状细胞转化为CAFs，并激活PDK1/AKT信号传导途径促进CAFs释放VEGF等血管生成细胞因子促进血管生成[15]。低氧可以刺激HCC细胞分泌含有miR-155的外泌体，从而促进血管生成，并且外泌体miR-155的水平与HCC样本中VEGF和HIF-1α的表达呈正相关[16]。因此，外泌体ncRNAs可通过激活相关通路，促进血管内皮生长因子的生成来调节肿瘤微环境中的血管重构，从而促进肿瘤血管生成。

2.4 外泌体ncRNAs调节HCC免疫反应癌症的发展与肿瘤免疫微环境密切相关，通过调节免疫反应，肿瘤可以逃避免疫破坏。肿瘤细胞可以通过外泌体将致癌的ncRNAs转移至免疫细胞，以诱导抑制T效应细胞等免疫抑制细胞的活性，最终导致局部或全身性免疫抑制。肝癌表现出的高度恶性、总体生存结果差与宿主免疫反应的抑制密切相关，肝癌细胞释放的外泌体可以抑制患者的免疫系统，并为转移性扩散做好准备。外泌体miR-23a-3p可以从内质网应激的HCC细胞向巨噬细胞转移，通过抑制PTEN激活PI3K-AKT途径，增加PD-L1表达并抑制T细胞活化，导致肿瘤免疫逃逸[17]。Liu等[18]研究发现，外泌体衍生的HMGB1激活B细胞，通过Toll样受体2/4和丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径促进TIM-1+Breg细胞扩增，表达高水平的免疫抑制细胞因子IL-10，并表现出对CD8+T细胞的强抑制活性，从而促进肝细胞癌免疫逃逸。在另一项研究中，源自HCC的外泌体lncRNA TUC339可调节巨噬细胞，导致IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子生成降低，吞噬作用受损以及M2极化，从而促进HCC进展[19]。

3 外泌体ncRNAs可作为HCC诊断和预后的生物学标志物

早期诊断可以改善HCC患者的临床结局，因为早期HCC可以进行根治性切除或肝移植，且术后生存率较高。目前，HCC的诊断分为病理诊断和临床诊断，临床诊断除患者病史外，要结合腹部超声、计算机成像、磁共振等影像学检查以及甲胎蛋白检测，但通过以上方法，易遗漏早期的小肿瘤。因此，需要更有效的生物标志物来改进小肿瘤的筛查。外泌体中的ncRNAs，因其被外泌体的双层脂质膜包裹，不受RNA酶的影响，在血清稳定，且在血清、尿液、唾液等各种体液中广泛存在，是液体活检的理想标本，因此，可成为HCC诊断的生物学标志物。Sohn等[20]研究表明，HCC患者的外泌体miR-18a、miR-222、miR-221和miR-224的血清水平显著高于慢性乙型肝炎或肝硬化患者。此外，与外泌体miRNA不同，血清循环miRNA在慢性乙型肝炎组和HCC组之间没有显示出明显的差异。表明外泌体miRNA比血清miRNA敏感性、特异性更高。在大鼠模型的HCC发育过程中，在不同阶段检测到四种失调最明显的miRNA，其中，miR-10b、miR-21减少，miR-122和miR-200a增加。在HCC早期，血清和血清外泌体中的4个miRNA比血清AFP改变更显著。接受者操作特征(ROC)分析的结果表明，AFP、miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122和miRNA-200a的组合产生的最高曲线下面积(AUC)为0.993，这可能成为早期诊断HCC的更好方式[21]。此外，血清外泌体lncRNA HEIH的表达水平在HCV相关的HCC患者以及HCV诱发的肝硬化或慢性肝炎患者存在差异[22]。

HCC的早期诊断利于患者及早手术治疗，而HCC患者术后是否会复发、总生存期长短，对患者整体预后情况的评估尤为重要。外泌体ncRNAs与HCC的临床分期、术后复发时间、总生存期等相关，可作为HCC预后的生物学标志物。研究表明，HCC患者的血清外泌体miR-665水平明显高于健康受试者，且与肿瘤大小、侵袭，临床分期和存活时间密切相关。血清外泌体miR-665水平越高，临床表现越差，表明血清外泌体miR-665可能是HCC诊断和预后的非侵袭性生物标志物[23]。与慢性乙型肝炎和肝硬化组相比，HCC组血清外泌体miR-125b水平较低，且 miR-125b水平较低的患者复发时间和总生存期均较短，表明血清外泌体miR-125b可能是肝切除术后HCC患者复发和存活时间的高度准确和有效的生物标志物[24]。Lee等[25]研究发现，循环外泌体lncRNA-ATB与TNM分期和其他预后因素相关，包括T分期和门静脉血栓形成。Cox回归测试的多变量分析发现，较高的lncRNA-ATB是HCC死亡率和疾病进展的独立预测因子，外泌体lncRNA-ATB高的患者的总存活和无进展存活率显著较低。结果表明循环外泌体lncRNA-ATB是HCC的新型预后标志物和治疗靶点[25]。HCC患者的血清外体lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的水平高于慢性乙型肝炎患者(AUC分别为0.719和0.750)，且ENSG00000258332.1的高表达与TNM分期、门静脉肿瘤栓塞、淋巴结转移和总生存期有关[26]。采用两组无病生存率的生存曲线分析circPTGR1的表达与预后的关系，发现circPTGR1低表达的HCC患者的预后要好于circPTGR1高表达的HCC患者的预后[11]。随着研究的深入，外泌体ncRNAs有望成为HCC诊断和预后的重要生物学标志物。

4 外泌体ncRNAs在肝癌中治疗的作用

部分外泌体ncRNAs可抑制HCC的生长，如人成体肝干细胞衍生的外泌体可以通过转移抗肿瘤的miRNA下调与细胞增殖有关的基因来抑制肝癌的生长，如miR-223靶向的Cyclin D1，miR-31靶向的E2F-2。此外，人肝星状细胞LX2分泌的外泌体中过表达miR-335-5p，可在体内传递至受体HCC细胞，抑制体外HCC细胞增殖并抑制体内肿瘤生长[6]。由此给我们启示，可以体外构建外泌体载体，将抑制肿瘤的ncRNAs装载至外泌体转移到HCC细胞可逆转其恶性表型，或增强HCC细胞对化疗药物的敏感性。目前该技术已经比较成熟，将“货物”载入外泌体的方法主要有“前转载”、“后转载”两种方式，而“后转载”中电穿孔法因参数容易控制，多种“货物”载入外泌体使用该方法[27]。Liang等[28]采用电穿孔技术将功能性的miR-26a加载到HEK-293T细胞来源的外泌体，而负载miR-26a的外泌体经清道夫受体选择性结合HCC细胞，通过抑制CCND2、CCNE2、CDK6等蛋白抑制HCC的生长和侵袭。外泌体ncRNAs可有效抑制HCC的生长侵袭、增强癌细胞对化疗药物的敏感性，且具有低生物毒性、低免疫原性、低致病性、更好的生物相容性等优点，因此，外泌体ncRNAs用于治疗HCC具有较良好的应用前景。

5 小结

HCC在全世界发病率和病死率极高，HCC早期诊断患者可手术切除，临床预后较好，而HCC晚期患者多采用化疗或靶向治疗，治疗效果欠佳，患者总生存期低。因此，发现用于早期诊断HCC以及治疗HCC的高灵敏度、高特异性生物学标志物具有重要意义。越来越多的研究发现，外泌体ncRNAs在HCC的发生发展、诊疗预后中起重要作用，且外泌体ncRNAs具有无创性、在体液中广泛存在、稳定性高、低生物毒性等明显优势，故外泌体ncRNAs今后有望成为HCC诊疗预后的重要生物标志物。