慢性乙肝患者血清Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平表达与病情程度相关性研究

刘宗萍（陕西省宝鸡市口腔医院检验科 陕西宝鸡 721000）

近年来，慢性乙肝患者患病率呈逐年上升趋势，由于疾病初期无特异性临床表现，故诊断困难，所以血清学指标检测在慢性乙肝患者疾病中的诊疗价值得到普遍关注[1-2]。为了研究血清学指标在慢性乙肝患者中的表达情况，本课题首先对所选取研究对象转化生长因子β1（TGF-β1），T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和乙肝表面抗原（HBsAg）表达进行分析，进一步对上述指标在慢性乙肝患者与正常患者中的表达水平及慢性乙肝患者与血清学指标进行Logistic分析，同时对上述指标与研究对象肝功能指标进行相关性分析，初步研究TGF-β1，Tim-3和HBsAg单项检测及联合检测对慢性乙肝患者检测的能效分析。通过本次研究旨在对慢性乙肝患者相关血清水平检测进行进一步的探讨。经查阅文献发现，当前临床并未发现关于上述指标与慢性乙肝病情评估中综合应用价值的系统性研究，基于此，本研究通过比较慢性乙肝患者和健康人群Tim-3，HBsAg和TGF-β1水平，探讨Tim-3，HBsAg和TGF-β1与疾病病情程度间的关联性及诊断价值，以期为疾病临床诊断提供新的思路及途径。报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取我院2017年10月～2019年6月收治的慢性乙肝患者103例作为研究组，另选取同期健康体检者103例作为对照组。纳入标准：研究组符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中慢性乙肝诊断标准[7]；年龄＜60岁；知晓本研究，签署同意书。排除标准：并发肝癌、肝内巨大血管瘤、肝内胆管结石；药物性肝损伤；哺乳期及妊娠期女性 ；并发免疫功能异常；并发全身性感染性病变、血液系统及代谢系统病变；纳入研究前3个月内采取抗病毒及免疫调节治疗。研究组男性56例，女性47例；年龄39～58岁，平均年龄48.06±4.91岁；病情程度：轻度28例，中度43例，重度32例。对照组男性59例，女性44例；年龄36～59岁，平均年龄47.89±5.10岁。两组性别、年龄等基线资料均衡可比（P＞0.05），且本研究经我院伦理委员会审批通过。

1.2 试剂和仪器 美国Bio-RAD公司Bio-RAD550型酶标仪，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司酶联免疫试剂，美国雅培公司Abbott Architect I2000型全自动化学发光免疫系统与配套试剂。

1.3 方法 两组均于入院后第2天空腹状态下抽取静脉血5 ml，3 000 r/min，离心10 min，取上清液，置于-20℃环境中储存待检，以酶标仪经酶联免疫吸附法测定肝功能指标（CG，ALT，AST，DBIL和TBIL）水平、TGF-β1水平；采取全自动化学发光免疫系统与配套试剂，经化学发光微粒子免疫法测定HBsAg表达情况；取新鲜肝素锂抗凝外周全血100μl，置于流式管内，加入PE-Tim-3，FITCCD8，APC-CD3荧光单克隆抗体，于4℃环境中避光孵育30 min，加入溶血素1 ml于室温下避光10 min，待其成真性溶液，离心处理，经PBS洗涤2次，以PBS 300μl重悬处理，经流式细胞仪测定Tim-3表达情况。

1.4 统计学分析 数据处理使用SPSS 24.0软件包，肝功能指标及TGF-β1，Tim-3及HBsAg以均数±标准差（±s）表示，t检验。敏感度、特异度、准确度以n（%）表示，χ2检验。慢性乙肝发病影响因素采用Logistic回归分析，血清各指标水平与慢性乙肝肝功能的关联性采用Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能指标比较 见表1。通过对两组患者肝功能指标进行比较，研究组患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（t=24.412～53.782，均P＜0.05）。

表1 两组患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比较（±s）

表1 两组患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比较（±s）

项 目 研究组（n=103） 对照组（n=103） t P CG（mg/L） 30.53±6.44 1.89±0.51 44.993 ＜0.001 ALT（U/L） 245.33±40.81 27.41±5.06 53.782 ＜0.001 AST（U/L） 160.27±25.76 31.29±4.41 50.087 ＜0.001 DBIL（μmol/L） 6.56±1.10 2.44±0.68 32.333 ＜0.001 TBIL（μmol/L） 22.69±5.91 8.28±0.98 24.412 ＜0.001

2.2 TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比较 见表2。研究组TGF-β1，Tim-3和HBsAg水平高于对照组，差异均有统计学意义（t=29.878～37.574，均P＜0.05）。

表2 两组患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比较（±s）

表2 两组患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比较（±s）

项 目 研究组（n=103） 对照组（n=103） t P TGF-β1（pg/ml） 71.13±10.18 28.79±6.44 35.672 ＜0.001 Tim-3（%） 24.44±6.06 4.70±2.87 29.878 ＜0.001 HBsAg（ng/ml） 3.83±1.01 0.09±0.02 37.574 ＜0.001

2.3 慢性乙肝发病影响因素的多元回归分析 见表3。以慢性乙肝发病作因变量，将性别、年龄、TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平作自变量进行Logistic回归分析，结果显示患者乙肝发病与性别（OR=1.527），年龄（OR=1.959）均属于独立危险 因 素(χ2=0.145～0.238，P＞0.05),而 患 者HBsAg（OR=2.234），Tim-3（OR=2.634） 及TGF-β1（OR=2.768）均为影响慢性乙肝发病的独立危险因素（χ2=5.862～11.140，均P＜0.05）。

表3 慢性乙肝患者发病影响因素Logistic分析

2.4 TGF-β1，Tim-3，HBsAg与肝功能指标关联性分析 见表4。通过对TGF-β1，Tim-3及HBsAg与CG，ALT，AST，DBIL，TBIL进行相关性分析，TGF-β1，Tim-3及HBsAg与ALT，AST，DBIL，TBIL均存在显著正相关关系（r=0.698～0.822,均P＜0.05）。

表4 TGF-β1，Tim-3及HBsAg与肝功能指标关联性分析

2.5 TGF-β1，Tim-3和HBsAg单独及联合诊断效能 见表5。TGF-β1，Tim-3和HBsAg的 敏感度、特异度、准确度在单独诊断时结果之间差异无统计学意义（χ2=3.241，2.145，P ＞0.05），联合诊断时敏感度、特异度、准确度均高于单独诊断，联合诊断与单独诊断结果经统计学分析，差异有统计学意义（χ2=9.662～22.685，均P＜0.05）。

表5 TGF-β1，Tim-3，HBsAg及联合诊断效能对比[%（n）]

3 讨论

由于在慢性乙肝发病机制中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可促使机体免疫系统活化，生成大量细胞因子，而宿主免疫功能状态在疾病发病机制中具有关键作用，可通过免疫应答对宿主自身细胞因子进行调节[8-10]。因此相关因子检测对慢性乙肝检测成为一个研究重点，Tim-3为近年来新发现的一类负性免疫调控因子，在肿瘤、自身免疫性病变、感染性疾病发生中均具有重要作用[11]。Tim-3通过和配体半乳糖凝集素-9（Galectin-9）结合后于调节性T细胞(Treg)活化过程中增加Tim-3蛋白表达水平，Tim-3水平增加可诱导Th1细胞凋亡并抑制Th1型免疫反应，从而调节慢性乙肝患者Th1/Th2平衡[12-13]。而Th1/Th2平衡与慢性乙肝患者病情程度的关联性具有重要意义[14]。张华琳等[15]研究表明，慢性乙肝患者Tim-3蛋白表达水平可以作为慢性HBV感染者病情变化的监测指标之一。这与本次研究Tim-3蛋白表达水平检测结果一致。而刘霞[16]研究指出，慢性乙肝患者外周血Tim-3表达水平显著高于健康组，且重度患者Tim-3表达水平较轻度患者更高。这与本研究研究组Tim-3水平高于对照组结果一致，这也提示Tim-3参与了慢性乙肝发生及进展过程。

TGF-β1可代表Treg特性及功能，在免疫调节反应中具有重要作用，其高表达状态可影响机体内HBV病毒的清除。临床研究表明，TGF-β1为肝纤维化关键介导因子，其可增加胶原基因表达、促使成纤维细胞生成，造成细胞外基质异常合成及堆积[17]。同时，学者黄国栋等[18]指出，TGF-β1水平在慢性乙肝早期即可异常增高，有望成为疾病早期诊断指标。DENG等[19]认为，TGF-β1可促使肝细胞损伤坏死、凋亡，其能作用于肝星状细胞，促使其转化为肝纤维母细胞，并合成大量胶原，加速肝纤维化进程。徐爱静等[20]研究结果表明，慢性乙肝患者TGF-β1表达水平明显增高，且和免疫失衡状态、肝纤维化具有密切关联性。操伟庆等[21]研究显示，慢性乙肝患者血清TGF-β1含量较正常水平明显增高，其参与了肝脏损伤及病情进展。本研究也表明，研究组TGF-β1水平高于对照组，与上述结果具有一致性，表明TGF-β1在疾病发生及进展中具有重要作用。此外，HBsAg为慢性乙肝治疗效果的重要评估指征，其定量监测结果和慢性乙肝患者肝细胞核中HBV DNA含量关系密切，能反映肝脏中共价闭合环状DNA表达情况[22]。同时，HBsAg还可直接反映机体免疫功能状态[23]。但既往多是分析HBsAg在慢性乙肝治疗效果评估中的应用价值，徐少华等[24]学者证实，HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清定量值可以作为慢性乙型肝炎血清学转换且不会因为输血等因素而进行变化，是一种较稳定的检测标志物，提示我们HBsAg血清表达作为诊断慢性乙肝的辅助指标之一，具有高稳定性。

在临床检测中，CG，ALT，AST，DBIL和TBIL均为临床评估肝脏功能的指标，若肝脏发生坏死或变性等损伤，则此类指标水平可出现明显异常。而本研究中，我们通过检测血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水 平 与Tim-3，HBsAg，TGF-β1进行相关性分析，结果表明肝功能指标与Tim-3，HBsAg，TGF-β1间存在显著正相关，且上述血清指标联合诊断敏感度、准确度等显著高于单独诊断。表明通过联合检测Tim-3，HBsAg，TGF-β1表达情况，不仅能提高慢性乙肝诊断准确性，最大程度降低漏诊及误诊风险，且可为肝功能的准确评估提供较为全面的检测方式，以此指导临床调整治疗方案，保证治疗有效性及针对性。综上所述，慢性乙肝患者Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平在疾病发生及进展中可以作为慢性乙肝进展的检测指标，通过联合检测Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平，可有效提升慢性乙肝诊断敏感度、准确度及特异度，从而提升检测准确率。本次研究由于纳入样本量过小及不具备大型实验室的研究规范，此项研究可作为参考，以期望后期有大样本研究，为疾病临床诊断提供新的思路及途径。