南美天胡荽及其根际土壤水浸提液化感成分分析

周旭 胡亚萍 葛晓敏 陈水飞 马方舟 丁晖

摘 要：為探讨南美天胡荽对其他植物种子萌发的影响以及筛选影响其他植物的主要化合物，该文采用种子萌发试验、气相色谱-质谱联用以及液相色谱-质谱联用的方法，分析了南美天胡荽不同溶剂浸提液对种子萌发的影响、南美天胡荽植株及其根际土壤浸提液成分。结果表明：（1）南美天胡荽不同溶剂浸提物均具有一定程度的抑制种子萌发作用。（2）气相色谱-质谱分析下，南美天胡荽植株水浸提液中共分离鉴定了35种化合物，其中，邻苯二甲酸二丁酯（15.2%）、10，15-十八烷二元酸（8.58%）、2，4-二叔丁基苯酚（6.81%）相对含量最高;根际土壤水浸提液中共分离鉴定了17种化合物，其中，油酸酰胺（26.47%）、正二十七烷（9.63%）、十六酸乙酯（4.83%）相对含量最高。（3）液相色谱-质谱分析下，南美天胡荽植株水浸提液共分离鉴定了109种化合物，ESI+模式下，L-苯丙氨酸（3 483.99 ng·mg-1）、木犀草素（2 306.64 ng·mg-1）含量最多，ESI-模式下，右旋奎宁酸（21 827.71 ng·mg-1）、绿原酸（12 589.25 ng·mg-1）含量最多;根际土壤水浸提液中共分离鉴定了93种化合物，ESI+模式下，丁酸（7 660.53 ng·mg-1）、棕榈酰胺（3 200.36 ng·mg-1）含量最多，ESI-模式下，正二十八酸（18 605.35 ng·mg-1）、蔗糖（12 183.23 ng·mg-1）含量最多。（4）南美天胡荽的潜在化感物质主要为脂肪酸类、酰胺类、酯类、芳香酸类化合物，而土壤中直接起化感作用的物质可能为丁酸、正二十八酸、羟基乙酸、油酸酰胺、棕榈酰胺、十六酸乙酯、苯甲酸，其中脂肪酸类化合物输入可能来源于南美天胡荽、土壤微生物和土壤动物，酰胺类、酯类、芳香类化合物则更可能来源于南美天胡荽植株。

关键词：气相色谱-质谱， 液相色谱-质谱， 化感成分， 南美天胡荽

中图分类号：Q948.1

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）12-1740-15

Abstract：In order to explore the effects of Hydrocotyle vulgaris on seed germination of other plants and to screen the main allelochemicals， the seed germination test was used to investigate the effects of leach liquors by different chemical solvents on seed germination， and the methods of gas chromatography mass spectrometry （GC-MS） and liquid chromatography mass spectrometry （LC-MS） were selected to analyse the compounds of water extracts of H. vulgaris and its rhizosphere soil which could affect other species. The results were as follows：（1） The different extracts of H. vulgaris inhibited the seed germinating of Raphanus sativus， Brassica chinensis， Cucumis sativus， and the inhibition effects were significant for Raphanus sativus. （2） By GC-MS， 35 and 17 compounds were identified from water extracts of plants and rhizospheric soils. The main compounds included dibutyl phthalate， 10，15-Octadecane diacid and 2，4-Di-tert-butylphenol in water extract of plants and oleic acid amide， N-hexadecane and ethyl palmitate in the water extract of rhizospheric soil. （3） By LC-MS， 109 and 93 compounds were identified from water extracts of plants and rhizospheric soils. By ESI+， L-phenylalanine and luteolin were the main compounds in water extract of plants and L-phenylbutyric acid and palmitamide were the main compounds in rhizospheric soil. By ESI-， L-phenylpropyl dextro-quinic acid and chlorogenic acid were the main compounds in water extract of plants， and L-phenylpropanoid octadecanoic acid and sucrose were the main compounds in rhizospheric soils. （4） These compounds included butyric acid， octadecanoic acid， glycolic acid， oleic amide， palmitamide， ethyl hexadecanoate， benzoic acid could affect the growing and surving of companion organism directly， which belonged to fatty acids， amides， esters and aromatic acids. These compounds included oleic amide， palmitamide， ethy hexadecanoate， benzoic acid may originate in plants or transformed from secretion of plants by soil organisms. The input pathways of butyric acid， octadecanoic acid， glycolic acid include seereting of plants transforming of micro organisms and soil animals.

Key words：gas chromatography mass spectrometry， liquid chromatography mass spectrometry， allelochemicals， Hydrocotyle vulgaris

化感作用是指植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物产生有利或不利的作用（Rice，1984）。植物通过淋溶、挥发、凋落物及残体分解、根系分泌等方式向土壤或空气中释放化学物质，而释放至土壤中的化学物质通过土壤物理吸附作用和土壤中有机体滞留、运输、转化作用将化感物质汇集至临界浓度，最终促进或抑制伴生物种的正常生长（Wahren et al.，1998;Kobayashi，2004;李广义等，2009;拱健婷和张子龙，2015）。植物化感物质几乎都是植物的次生代谢产物，一般分子量较小，结构较简单，大致分为水溶性有机酸、直链醇、脂肪族醛和酮;简单不饱和内酯;长链脂肪酸和多炔;醌类;苯甲酸及其衍生物;肉桂酸及其衍生物;香豆素类;内黄酮类;单宁;内萜;氨基酸和多肽;生物碱和氰醇;硫化物和芥子油苷;嘌呤和核苷等14类（Calleway & Aschehoug，2000）。

植物化感作用是解释外来物种入侵的重要机制，筛选出影响其他植物生长的化感物质对探究外来物种入侵机制、制定入侵物种防控策略有重要作用。紫茎泽兰（Ageratina adenophora）主要化感物質包括绿原酸、黄烷酮、泽兰二酮、羟基泽兰酮、9-羰基泽兰酮等成分（杨国庆，2006;Liao et al.，2015;郭娇，2016;李霞霞等，2017），这类物质可以引导旱稻（Oryza sativa）根细胞丙二醛、过氧化氢酶活力改变，脱落酸、吲哚乙酸等激素水平的生理生化指标失调，还能使旱稻根尖顶端分生组织、皮层薄壁细胞等解剖结构发生改变（Yang et al.，2006; Yang et al.，2008）;土荆芥（Dysphania ambrosioides）主要化感物质包括α-萜品烯和对伞花素（周健等，2016），这两种物质将通过调控ROS 和NO水平，引起保卫细胞Ca2+浓度的改变，从而调控蚕豆（Vicia faba）气孔保卫细胞的凋零过程（周健等，2016，2017）。GC-MS和LC-MC常用于化学成分鉴定，GC-MS分析在入侵物种化感作用研究中具有较长历史，普遍用于植物挥发物以及植物浸提液化学成分分析（冀晓青等，2012;高远等，2017），但GC-MS分析更适合易挥发物质的鉴定，而LC-MS分析则更适合极性和非挥发性物质的鉴定（李坤等，2010;郭修武等，2011），因此，结合GC-MS和LC-MS可能是鉴定筛选植物化感物质的更为完善的方法。

南美天胡荽（Hydrocotyle vulgaris），属伞形科植物，原产于欧洲、北美洲及中美洲地区，引入我国后，常被用于湿地造景（缪丽华等，2011），由于其生物学特征，被评估为对我国热带、亚热带湿润区具有较高的入侵风险（缪丽华等，2011;Yang et al.，2013;Liu et al.，2014;Dong et al.， 2015）。本研究拟结合GC-MS和LC-MS分析对南美天胡荽及其根际土壤化学成分分析，以期筛选出南美天胡荽分泌至土壤中可能具有化感作用的物质，为进一步研究其化学生态学提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

植物材料取自南京外港河，选取长势均匀，生长良好，无病虫害的整株南美天胡荽植株，将冲洗干净的植株置于房间内阴干，用碾磨仪（Mixer Mill MM 400， Retsch Germany）将南美天胡荽制备成粉末;土壤材料取自南美天胡荽根际土，取样方法为抖土法（刘辰琛，2011），土壤样品在室内阴干，碾成粉末并过筛备用。受试种子为黄瓜（Cucumis sativus）、萝卜（Raphanus sativus）和青菜（Brassica chinensis） 3种植物种子（购于南京市星光种业种子公司）。

1.2 南美天胡荽不同浸提液的制备

分别称取5 g南美天胡荽粉末，以南美天胡荽粉末∶各浸提溶剂（蒸馏水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷）=1 g∶40 mL的比例配置南美天胡荽浸提液，摇匀并静置48 h，再将浸提液分别用定性滤纸过滤2次，得到的滤液（甲醇浸提液、乙酸乙酯浸提液、正己烷浸提液，水浸提液直接定容至200 mL）用旋转蒸发仪（Hei-VAP Value， Heidolph， Germany）减压旋蒸，最终得到浸提物浸膏，将浸膏置于80 ℃水浴2 h去除剩余溶剂，再将浸膏刮至200 mL蒸馏水中，充分搅拌，得到南美天胡荽浸提悬浊液。

1.3 南美天胡荽不同浸提液对种子萌发的影响

以黄瓜、萝卜、青菜种子作为受试对象，黄瓜种子选取30粒，杨花萝卜、上海青种子各选取50粒，分别用2%高锰酸钾溶液消毒15 min，再用蒸馏水冲洗3次，将洗净的种子均匀摆放在铺有2层滤纸、直径为90 mm的培养皿中，分别加5 mL不同溶剂浸提悬浊液（对照组为蒸馏水），每个处理设置3个重复，最后放置于光照培养箱（GXZ-338A，宁波江南仪器厂）中进行培养。培养条件为光周期/暗周期=13 h/11 h;培养温度27 ℃，种子萌发以胚根突破种皮为标准。每隔24 h记录一次种子萌发数，并再次加入5 mL不同溶剂浸提悬浊液，监测时间为10 d。

1.4 南美天胡荽及其根际土水浸提液的制备

分别称取5 g南美天胡荽粉末和根际土壤粉末，以南美天胡荽粉末（土壤粉末）∶浸提溶剂=1 g∶40 mL的比例制备南美天胡荽及其根际土壤水浸提液，浸提溶剂选择蒸馏水，置于摇床上摇匀，并将浸提液分别过滤2次备用。

1.5 GC-MS分析方法

将南美天胡荽及其根际土壤水浸提液过0.22 μm有机膜，另外将水浸提液进行冷冻干燥，再用乙酸乙酯进行萃取，过0.22 μm有机膜，待测。GC-MS分析采用Agilent6890N-G5795B气象色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司），色谱柱为Agilient HP-5MS毛细管柱（30 cm×0.25 cm×0.25 μm），柱温40 ℃（保留2 min），以8 ℃·min-1升温至200 ℃，保持1 min，再以15 ℃·min-1升温至280 ℃，保持20 min;载气为高纯He（99.999%），柱前压7.62 psi，载气流量1.0 mL·min-1，不分流进样，延迟时间1 min，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为180 ℃，进样口温度250 ℃。

1.6 LC-MS分析方法

分别将南美天胡荽及其根际土壤水浸提液进行冷冻干燥，称取50 mg南美天胡荽和土壤冷冻干样品，加入800 μL 甲醇和10 μL内标（2.9 mg·mol-1，二氯苯丙氨酸），将其置于组织研磨仪中研磨45 s（65 Hz），涡旋混匀30 s，置于4 ℃离心机中，12 000 r·min-1离心15 min，吸取200 μL上清液，待LC-MS检测分析。

LC-MS分析采用Thermo， Ultimate 3000 LC， Orbitrap Elite液相色谱-质谱联用仪器（美国赛默飞世尔科技公司），色谱柱采用Hypersil GOLD C18色谱柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm。色谱分离条件：柱温40 ℃;流速0.3 mL·min-1;流动相A为水+0.1%甲酸，流动相B为乙腈+0.1%甲酸;进样量为4 μL;自动进样器温度4 ℃。

1.7 数据分析

供试种子的萌发率、相对萌发速度以及化感效应指数按以下公式（曾任森，1999;桂富荣等，2011）计算。

（1）Rg=（Mg /M）×100%。式中：Rg是萌发率;Mf是萌发种子数;M是供试种子数。

（2）Rrg=（Rt/Rc）×100%。式中：Rrg是相对萌发率;Rt是处理组萌发率;Rc是对照组萌发率。

（3）RI=（1-Rt/Rc）×100或RI=（Rt/Rc-1）×100。式中：RI是化感效应指数;Rt是处理组萌发率;Rc是对照组萌发率。

采用软件Excel、SPSS 22.0、Origin 9.0对数据进行整理、分析以及画图，用单因素方差分析比较不同浸提液处理下种子根苗长的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 南美天胡荽不同浸提液对种子萌发的影响

四种溶剂浸提液处理下的种子萌发受到的抑制作用并不大，表明南美天胡荽浸提液对黄瓜种子萌发影响较小;相较于黄瓜种子，对青菜、萝卜种子萌发的抑制作用更为明显，萝卜种子受到的抑制作用最为强烈，青菜种子受到的抑制作用次之（图1）。化感效应指数是衡量浸提液影响强度的重要指标，四种溶剂的南美天胡荽浸提液对黄瓜种子的抑制作用均非常弱（|RI|≤0.02），而对青菜、萝卜种子的抑制作用较为明显（青菜|RI|最大值为0.81;萝卜|RI|最大值为0.75）（图2）。

2.2 南美天胡荽及其根际土水浸提物的GC-MS分析

将南美天胡荽及其根际土壤的水浸提物进行GC-MS分析，总离子流图见图3和图4。由表1可知，南美天胡荽水浸提液共有有效命名35种化合物，分别属于烷烃类、醇类、酸类、酚类、酮类、糖类以及糖苷类，其中酯类化合物含量最多，为35.34%，其次是酸类、醇类，为13.26%、10.14%，35种化合物中以邻苯二甲酸二丁酯、10，12-十八碳二炔酸、2，4-二叔丁基苯酚、6-[（1E）-3-羟基-1-丁烯基]-1，5，5-三甲基-杂氧双环[4.1.0]庚-3-醇、十六酸乙酯、（6R，7E，9R）-9-羟基-4，7-巨柱头二烯-3-酮为主，含量分别为15.2%、8.58%、6.81%、6.10%、4.52%、4.78%。

南美天胡荽根际土壤水浸提液中共有有效命名17种化合物，分别属于烷烃类、烯烃类、酚类、酯类、酰胺类、糖类，其中酰胺类化合物含量最多，为26.47%，其次是烷烃类、酯类，为15.75%、11.93%，17种化合物中油酸酰胺最多，为26.47%，其次是正二十七烷、十六酸乙酯，为9.63%、4.38%。南美天胡荽及其根际土壤水浸提液中共有8种相同化合物，分属烷烃类、酯类以及糖类，但共有成分在植株以及土壤中均不是主要成分。

2.3 南美天胡荽及其根际土壤水浸提液LC-MS分析

将南美天胡荽及其根际土壤水浸提液进行LC-MS分析，总离子流图见图5、图6、图7、图8。从表2可以看出，正离子模式下，植物水浸提液中以氨基酸及其衍生物、酚酸、黄酮类化合物为主，氨基酸及其衍生物，相对含量达到6 495.50 ng·mg-1，酚酸类化合物含量为2 651.16 ng·mg-1，黄酮类化合物含量为2 306.64 ng·mg-1，植物水浸提液中相对含量较大的化合物为L-苯丙氨酸、咖啡酸以及木犀草素，分别为3 483.99、2 045.91、2 306.64 ng·mg-1;根际土壤中脂肪酸类化合物相对含量最大，相对含量达到10 561.55 ng·mg-1，酰胺类、维生素类化合物，相对含量分别为3 200.36、2 989.29 ng·mg-1，土壤水浸提液中相对含量较大的物质为丁酸、棕榈酰胺以及苯乙烯，分别为7 660.53、3 200.36、2 704.13 ng·mg-1。

从表3可以看出，负离子模式下，植物水浸提液以二元酸类、酚酸类、糖类以及衍生物为主，相对含量分别为23 455.88、16 959.38、11 570.66 ng·mg-1，其中相对含量较大的化合物为右旋奎宁酸、蘋果酸以及绿原酸，相对含量分别为21 827.71、12 369.30、12 589.25 ng·mg-1;根际土壤中以脂肪酸、糖类及衍生物类化合物为主要化合物，相对含量分别为19 801.71、12 945.74 ng·mg-1，其中相对含量较大的化合物包括正二十八酸、蔗糖以及维生素A酸，相对含量分别为18 605.35、12 183.23、8 187.75 ng·mg-1。

3 讨论与结论

3.1 南美天胡荽不同浸提液的萌发抑制作用

本研究结果表明，25 g·L-1不同溶剂的南美天胡荽浸提液对青菜与萝卜均有抑制作用，这与杨琴琴等（2013）认为研究结果一致，说明南美天胡荽具有抑制其他植物种子萌发的能力，而南美天胡荽对黄瓜种子的抑制作用较弱，与其研究结果不同则可能是由于南美天胡荽浸提液浓度较其选用的浓度50 g·L-1更低。

3.2 南美天胡荽及其根际土壤水浸提液成分比较

化感物质是化感作用的主要载体，物质成分几乎都是植物的次生代谢产物，分子量较小，结构较简单， 通常被认为能通过根系分泌、雨水淋溶、残枝腐解等方式释放至土壤，这些物质往往具有通过物理或者化学作用影响其他植物生长的能力，或者通过土壤微生物活动转化成能够影响其他植物生长的物质能力（Bonanomi et al.，2006;Fernandez et al.，2008;孙庆花等，2016;郭晓燕等，2018），因此本研究采取分析植株以及根际土壤水

浸提液化学成分探讨南美天胡荽影响其他植物的可能物质。

由于土壤中化学物质成分最终直接作用于其他生物， 因此本文将比较分析土壤中主要成分以及植物、土壤的共有主要成分。其中酯类、氨基酸类物质在土壤中含量明显减少，而脂肪酸类、酰胺类、酚类、核酸和碱基类、维生素类、芳香酸类、羟基酸类以及糖类物质在土壤中含量明显增加。酯类、脂肪酸类、酰胺类、酚类、芳香酸类、维生素类、羟基酸类物质在土壤中含量较多，并且这些种类的物质已被证明具有化感作用（高云霞等，2011;李光等，2017;谢东峰等，2018;董颖娜等，2018），另外在以往的研究中酚酸类物质通常是重要的化感物质（李培栋等，2010），因此尽管土壤中酚酸类物质减少，判断酚酸类物质是否是南美天胡荽的主要化感物质仍需要进一步的验证。分析南美天胡荽水浸提液和根际土壤水浸提液具体物质，土壤水浸提液中物质主要包括油酸酰胺、正二十七烷、十六酸乙酯、棕榈酰胺、醋酸、丁酸、苯甲酸、羟基乙酸、正二十八酸、维生素A酸，油酸酰胺是芦苇叶中重要的化感成分（叶小齐等，2016），丁酸是黄菖蒲、杉木枯枝落叶中主要化感物质（刘学芝，2006;陈国元等，2013），棕榈酸、亚油酸是重要的化感物质（舒俊等，2016），与其相关的棕榈酰胺可能是南美天胡荽根际土壤中重要的化感物质，而正二十八酸则被报道对富营养化水体藻类具有抑制作用（张胜花，2009），羟基乙酸可能是露珠杜鹃林下土壤中的化感物质（李朝婵等，2018），十六酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚已被验证具有化感作用（舒俊等，2016），毛红椿落叶腐解物中主要成分则是苯甲酸（郭晓燕等，2018）。

土壤水浸提液主要物质中，丁酸、正二十八酸、羟基乙酸属于脂肪酸类，油酸酰胺、棕榈酰胺属于酰胺类，十六酸乙酯属于酯类，苯甲酸为芳香酸类，正二十七烷属于烷烃类，对比植株与土壤水浸提液主要物质，土壤水浸提液中主要物质在植株水浸提液中含量均不高，因此土壤中可能存在转化或者其他输入过程。土壤脂肪酸主要来源于植物、微生物和土壤动物（Otto & Simpson， 2005），因此土壤微生物和土壤动物可能是土壤脂肪酸输入的其他主要来源，另外植物分泌的酯类物质的分解同样也可能是土壤脂肪酸输入的一个途径。油酸酰胺、棕榈酰胺是土壤水浸提液中主要成分，然而植物水浸提液中鉴定出大量的油酸和棕榈酸，尽管土壤中油酸酰胺和棕榈酰胺的合成动力学尚不清楚，但植物源油酸和棕榈酸可能成为土壤中酰胺类物质的来源。十六酸乙酯在土壤和植物水浸提液中均有較大的含量，因此土壤中十六酸乙酯的一个重要输入可能来源于南美天胡荽植株。烷烃类物质是土壤中重要物质，并且植物中烷烃类物质较少，而烷烃类物质相对稳定，因此正二十八烷的输入来源可能并不是南美天胡荽。芳香酸类物质在植株中含量较少，但植株中含有大量的酚类和酚酸类物质，土壤中苯甲酸可能来自于植株的输入。

因此，对比分析南美天胡荽植株水浸提液和根际土壤水浸提液化学物质，脂肪酸类、酰胺类、酯类、芳香酸类可能是南美天胡荽的潜在化感物质，丁酸、正二十八酸、羟基乙酸、油酸酰胺、棕榈酰胺、十六酸乙酯、苯甲酸则可能是南美天胡荽根际土壤中直接影响其他植物的化学物质，其中脂肪酸类物质包括丁酸、二十八酸以及羟基乙酸输入来源不仅是南美天胡荽植株，而且微生物和土壤动物输入可能占更大比例，酰胺类、酯类、芳香酸类物质包括油酸酰胺、棕榈酰胺、十六酸乙酯、苯甲酸则可能主要依靠南美天胡荽植株输入。

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（责任编辑 何永艳）