基因枪介导抗草甘膦基因对玉米自交系A188的遗传转化

韩平安，吴新荣，孙瑞芬，常 悦，石海波，唐宽刚，梁亚晖，李晓东

（1.内蒙古自治区农牧业科学院生物技术研究中心，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

玉米为世界上重要的粮饲兼用作物，同时在化工、生物科技领域被大量利用。玉米是内蒙古地区播种面积和总产量第一的主栽粮食作物，在内蒙古地区种植业结构占比较大，但是总体以中低产田为主，产量偏低，很重要的原因是杂草危害，国内抗除草剂种质资源相对匮乏，使得这一问题尤为突出。因此，利用基因工程技术引入除草剂抗性基因培育抗除草剂品种是控制杂草提高生产力的有效途径。

玉米遗传转化方法主要为农杆菌和基因枪介导，相对较大的DNA片段通常采用农杆菌介导法，该方法转化效率较高，可得到较多的单拷贝后代，但对受体类型和受体材料基因型要求较高。基因枪介导法通常利用高速氦脉冲物理传递金属粒子结合DNA 进入植物细胞，尤其是粒子速度和射入受体细胞深度可人为控制[1]，操作简便快捷，无宿主限制，应用广泛[2]，成为备受关注的转基因方法。

本研究以自交系A188 幼胚愈伤组织为受体材料，利用构建的抗草甘膦基因（EPSPS）的植物表达载体，通过基因枪介导进行遗传转化，完善玉米转基因技术体系，探索提高遗传转化效率新途径，以期获得稳定遗传的草甘膦抗性玉米转基因植株，培育抗除草剂玉米自交系，丰富内蒙古地区抗除草剂玉米种质资源，同时对于促进玉米分子育种具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 试验材料为玉米自交系A188，由内蒙古自治区农牧业科学院玉米研究所提供。

1.1.2 质粒 质粒pBWA（V）BU-cp4EPSPS 含有BAR基因和cp4EPSPS基因，35S启动子启动BAR基因，UBI启动子启动cp4EPSPS基因。质粒pBWA（V）BU-GUS 携带GUS基因。

1.1.3 培养基 试验所用培养基组分及pH值见表1。

表1 培养基配方

1.2 试验方法

1.2.1 幼胚大小的确定 分批播种供试材料并按照试验的进程进行授粉，在套袋授粉的10～15 d，选取1.0 mm 以下、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm、2.0 mm 以上4种大小的幼胚果穗，经75%酒精消毒处理后，用解剖刀切去已消毒幼穗籽粒的1/2，挑取幼胚置于诱导培养基上，28℃暗培养诱导愈伤组织的形成。

1.2.2 愈伤组织的继代培养 14～21 d后，将诱导出的愈伤组织转移到新鲜的诱导培养基上继代培养，每14 d 继代1次。

1.2.3 预培养 将继代培养后10 d的愈伤组织用于基因枪轰击，此时愈伤组织松脆、嫩黄色、生长旺盛。用镊子将愈伤组织夹碎均匀紧密地排布在高渗培养基中心位置，预培养4～6 h后用于基因枪转化。

1.2.4 微弹制备与轰击 采用天根质粒中量试剂盒分别提取大肠杆菌质粒pBWA（V）BU-cp4EPSPS 和pBWA（V）BU-GUS 作为对照。分别称2份3 mg 金粉加入灭菌低吸附EP 管中，对金粉进行灭菌后向离心管中加15 μL Tris Buffer，冰浴1～2 h。重新悬浮振荡在Tris Buffer 中的金粉，将含有金粉的离心管放进超声清洗器中，超声20 s，打开离心管加5 μL DNA（浓度为1 μg/μL）混合10 s，加20 μL 亚精胺用枪轻轻吹打混合20 s，加20 μL PEG 用枪轻轻吹打混合20 s，加入20 μL CaCl2，盖上离心管轻柔混合2 min 20 s，在室温条件下孵育10 min。将离心管8 000 r 离心20 s，用移液器移除上清并丢弃，加100 μL 无水乙醇，轻弹使金粉悬浮，将其放入超声波清洗器中超声3 s 迅速取5 μL 金粉悬浮液加到载物膜中央。

分别用含有pBWA（V）BU-cp4EPSPS 和pBWA（V）BU-GUS的微弹进行基因枪轰击，轰击方法按照操作说明进行。轰击完毕的愈伤组织置于高渗培养基中，28℃暗培养16 h。

1.2.5 筛选培养和植株再生为了对基因枪介导法转化结果进行早期鉴定，对过夜培养后GUS 载体愈伤组织进行染色，染色方法按照GUS 试剂盒（北京华越洋公司） 说明书进行，借助显微镜（Nikon Eclipse Ni-U）观察染色结果。同时将cp4EPSPS 愈伤组织转入含有1.5 mg/L 植物筛选标记双丙氨膦的筛选培养基Ⅰ中，培养1个周期，每个周期为14 d，之后在含有3 mg/L 双丙氨膦的筛选培养基Ⅱ培养2个周期，促使愈伤组织分化。获得的抗性愈伤组织移至再生培养基诱导不定芽分化，28℃条件下，光照18 h/d。待不定芽长度为2.5～3 cm 时转移至生根培养基中诱导生根，获得抗性植株。

1.2.6 转基因植株PCR 鉴定 使用天根DNA 提取试剂盒提取抗性植株及其对照玉米叶片的DNA。依cp4EPSPS基因的序列，设计的引物可特异扩增cp4EPSPS基因目的片段，上游引物为：5′-GACGAA TATCCGATTCTCGC-3′；下游引物为：5′-CAAGAC CGGCAACAGGATTCAATC-3′。体系为12.5 μL，Mix 6.25 μL，上下游引物各（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 3.25 μL，模板（50 ng/μL）2 μL。PCR 反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，用Bio-Rad GelDoc XR+凝胶成像系统分析电泳结果。

1.2.7 转基因植株的草铵膦（PPT）抗性鉴定 将PCR 检测为阳性的组培苗炼苗3～4 d，移栽至花盆里。在五叶一心期，用棉签将120 mg/L PPT 涂抹于距离叶片尖端1/3 处的第4片叶，涂抹长度为2 cm，观察植株受害情况[3]。

2 结果与分析

2.1 幼胚大小对愈伤组织诱导的影响

玉米幼胚诱导的愈伤组织为基因枪轰击法的主要影响因素，其对幼胚大小要求较严。分别选取1.0 mm 以下、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm、2.0 mm 以上4种大小的幼胚，并对不同大小胚诱导的愈伤组织进行GUS 染色分析。结果表明，当幼胚大小在1.5～2.0 mm 时，愈伤组织的表达效率最高，幼胚大小为1.0～1.5 mm 时愈伤组织的表达效率次之，1.0 mm以下幼胚愈伤组织表达效率最低（图1）。结果发现，1 mm 以下的幼胚很难诱导愈伤组织，大于2.0 mm的幼胚，随着胚的增大，再生性降低，愈伤组织诱导能力差，很难成苗。

2.2 双丙氨膦筛选浓度确定

自交系A188 愈伤组织在双丙氨膦浓度为1 mg/L时，轰击的愈伤组织大部分能正常生长，有少量轰击的愈伤组织开始变褐；当双丙氨膦浓度为2 mg/L时，轰击的愈伤组织1/2 能正常生长，一半开始变褐；双丙氨膦浓度为3、4、5 mg/L 时，轰击的愈伤组织开始全部变褐，浓度为5 mg/L 时，未正常生长愈伤，说明3 mg/L 双丙氨膦浓度是试验筛选的最佳浓度（图2）。

2.3 GUS 瞬时表达

为了测试基因枪轰击转化系统的工作效率，使用亚精胺分别包裹携带有目的基因和GUS基因的质粒轰击继代预培养10 d 左右的未成熟胚性愈伤组织，在高渗培养基上培养16 h 左右（图3），经基因枪轰击后染色观察愈伤组织的瞬时表达情况（图4）。结果表明，30个愈伤组织有27个具有蓝色斑点，且每块愈伤组织染色斑点数较多，说明受体材料状态与基因枪转化流程可行。

2.4 转基因植株的PCR 检测

经双丙氨膦抗性筛选共得到82株抗性苗，通过PCR 扩增检测目的基因，共有5株抗性苗扩增出目的条带（图5），表明目的基因已经整合到自交系A188 染色体基因组中。

2.5 转基因植株的草铵膦（PPT）抗性鉴定

将转基因植株移栽至花盆中，在五叶一心期进行除草剂抗性鉴定，将5株转基因植株和对照植株叶片涂抹120 mg/L PPT 7 d后观察植株受害情况，结果表明，转基因植株叶片颜色无变化，依然保持绿色，对照植株（非转基因）叶片涂抹处及周边部位变黄变枯（图6）。综合PCR 分析和除草剂抗性鉴定试验结果，证明目的基因已整合到自交系A188基因组中，且正常表达。

3 讨论与结论

为了完善玉米转基因技术体系，探索提高遗传转化效率新途径，本研究基于前期研究基础[3]，探讨了转化用受体材料大小及转化后双丙氨膦筛选浓度等因素对遗传转化的影响。

幼胚大小决定了愈伤组织的分化状态，是遗传转化的关键因素，胚大小不同愈伤组织诱导率也存在差异[4-5]。楚海娇等[6]研究发现，玉米幼胚在1.2～2.0 mm大小比较适宜转化，田风龙[7]研究发现，大田中玉米授粉后10～15 d，温室中授粉20～25 d的幼胚，长度为1.0～2.0 mm的幼胚较适合用来建立受体系统。多项研究发现，玉米幼胚在1.5～2.0 mm 大小比较适宜转化[8-10]，这与本试验结果一致。

在转化筛选过程中，除草剂浓度会影响幼胚愈伤组织的形成，筛选浓度过高，受体愈伤组织材料分化受到抑制，褐化死亡率升高，筛选浓度过低，受体愈伤组织材料后期假阳性比例会随之增高，增加检测工作量。VAIN 等[11]对玉米A188×B73 遗传转化体系研究中发现，PPT的筛选浓度为3 mg/L，邸宏等[12]在研究bar基因转化玉米幼胚时发现，当PPT 浓度达到10 mg/L 时，将近1/2的愈伤组织褐化死亡。考虑到PPT 对植株伤害具有累加性，因此选用8 mg/L作为筛选临界浓度。杨朝国等[13]对抗除草剂草丁膦转基因玉米后代筛选方法的研究时确定最佳PPT筛选浓度为30 mg/L。本研究筛选除草剂为双丙氨膦，最佳筛选浓度为3 mg/L，除草剂筛选浓度不同，与除草剂作用机理不同和受体材料基因型不同等因素有关。

基因枪介导是玉米转基因研究的主要方法之一，建立高效的转化体系是基因枪法的重要前提。本研究发现，除了以上两个因素外，对受体材料进行高渗处理可以提高转化率。徐立华[14]、伍晓丽[15]研究发现，加入适量甘露醇的诱导培养基提高其渗透压，改善胚性愈伤产生。任江萍等[16]研究发现，高渗处理对愈伤组织的分化有明显的促进作用，其作用程度因浓度的不同而异，甘露醇浓度为0.5～1.0 mol/L 比较适宜，过高或过低都不利于愈伤组织的分化。赵天永等[17]使用N6 高渗培养基加0.4 mol/L的甘露醇GUS基因瞬时表达量明显增加，李燕燕[18]研究发现，愈伤组织先干燥，再高渗处理的转化率比单纯高渗处理要高。在本研究中，高渗培养基加0.4 μmol/L的甘露醇促进愈伤组织的分化，利于提高转化率。

本研究采用基因枪介导对自交系A188 幼胚诱导的愈伤组织进行遗传转化，结果表明，幼胚大小1.5～2.0 mm、双丙氨膦筛选浓度为3 mg/L，转化效率较高，PCR 检测获得5株抗草甘膦转基因苗，经表型鉴定具有较强的PPT 抗性。