拉曼光谱技术在乳腺癌临床应用方面的研究进展

申李胜男,李思敏，李 倩，麻 帅，韩 冰

(吉林大学第一医院乳腺外科，吉林 长春 130021)

2018年，世界卫生组织宣布有62.7万女性死于乳腺癌，占女性因恶性肿瘤死亡人数的15%，全世界约有200万新确诊病例[1]。在过去的几十年里，全球乳腺癌发病率持续增加，其中发达地区的发病率更高[2-4]。乳腺癌筛查通常采用影像学(钼靶和超声相结合)和体格检查的方式，可疑为乳腺癌的患者需进行穿刺或切除活检，其中70%～90%的患者在活检中确诊为良性，患者承受了不必要的创伤、巨大的精神压力和高额的医疗费用[5-6]。乳腺癌保乳手术采用不同颜色染料标记切除病灶各个切缘，应用石蜡病理判断切缘是否有病灶残留，但该方法耗时长，无法在当次手术中确定切缘情况，导致保乳手术的二次手术率高达 17%，增加了患者身心痛苦和经济负担，因此急需一种无创、方便和即时的技术进行判断。拉曼光谱具有无需样品制备、对样品无接触、不破坏样品结构、分析简便快速和分辨率高等特点，因而可应用于疾病的预测、诊断及疗效判断。近年来，拉曼光谱检测技术不断完善，且统计学方法广泛应用于拉曼光谱结果的分析，使探索应用肿瘤的拉曼光谱特点进行诊断成为新的研究热点，目前国内外综述内容主要集中于拉曼光谱技术在细胞和组织中的研究结果及光谱归属等方面，但拉曼光谱测量仪器以及拉曼光谱技术的改进、乳腺癌拉曼光谱临床应用的相关综述国内尚无报道。本文作者系统回顾了近年来拉曼光谱测量仪器以及拉曼光谱技术的变化，对拉曼光谱在乳腺癌细胞系和组织检测的研究进展及其临床意义以及拉曼光谱临床应用时待解决的问题和未来的发展趋势进行综述。

1 乳腺癌临床研究中拉曼光谱技术的进展

拉曼光谱检测仪器与方法的改进促进了拉曼光谱技术在乳腺癌中的研究。最初的检测方法是自发拉曼光谱(Raman spectroscopy)，当光被物质散射时，绝大部分光子会发生弹性散射，还有一小部分光子会与介质分子发生非弹性碰撞，散射光子与分子相互作用产生能量交换，这种现象称为非弹性散射。拉曼散射效应最早由印度物理学家 RAMAN C.V.发现，激发光使用可见光或者近红外光，降低了水的吸收，使得拉曼光谱可应用于体液或者液体环境下细胞的测量[7]。

但是生物样本(组织、细胞和体液)的自发信号弱，检测时间长，易受荧光干扰。1973年表面增强拉曼散射光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)首次在吸附于粗糙银电极的吡啶上观察到，与传统的拉曼散射方法相比有几个数量级的增强。SERS的增强机制目前认为主要有2种：第1种为电磁场增强机制,激发光刺激惰性贵金属(金和银等)纳米颗粒产生等离子激元，等离子激元与拉曼活性分子相互作用，导致分子拉曼光谱信号增强105～1010倍[8]；第2种为化学增强机制,样本表面分子与金属表面的成键等相互作用，从而使分子拉曼光谱信号增强。虽然测量物质与增强剂不需要接触就能发生SERS增强，但在1～30 nm范围内SERS增强效应较强[9-11]，因此在术中检测应用时应加入生物相容性较好的纳米颗粒，检测位点应尽量接近纳米颗粒。

共振拉曼光谱(resonance Raman scattering, RRS)入射光频率与分子电子跃迁频率一致时相应分子的光谱增强102～106倍，当共振分子光谱增强时未共振光谱信息被湮灭，而无需加入任何样本的预处理。即使在拉曼光谱信号复杂的样品中，RRS只提供部分分子的信息，降低光谱的复杂性而便于识别。但RRS易受荧光背景的影响，应使用短波长的激发光加以避免，而短波长激发光容易造成组织损伤，不适合用于活体检测。

移频激发差分拉曼光谱(shifted-excitation Raman difference spectroscopy, SERDS)通过拉曼光谱和荧光光谱对激发光波长的依赖程度不同，有效解决了生物样本检测拉曼光谱时荧光干扰的困扰[12-13]，因此成为避免荧光干扰最常用的手段。在一定的范围内，随着激发波长的变化荧光光谱几乎不会发生改变，而激发波长对拉曼光谱中荧光有很大影响。采用2个相近频率的激发光照射样品，对得到的2组光谱进行差分处理消除荧光的干扰，可得到只包含拉曼光谱信息的数据。SERDS检测正常乳腺组织、纤维腺瘤和浸润性乳腺癌，判断是否含有病变组织的敏感度和特异度均达到100%[14]。相干拉曼散射(coherent Raman scattering, CRS)是一个典型的采用皮秒脉冲激光器的三维非线性过程，CRS通过相干激励增强信号，可以大幅缩短数据采集时间。当泵振动和斯托克斯振动频率与分子的振动频率发生共振时，将有4种主要的CRS过程同时发生：相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering spectrum,CARS)、相干斯托克斯拉曼散射(coherent stokes Raman scattering spectrum,CSRS)、受激拉曼增益(stimulated Raman gain,SRG)和受激拉曼损耗(stimulated Raman loss,SRL)。通常在 CARS 过程中还会伴有非共振的四波混频信号，这种非共振背景将导致 CARS 光谱与自发拉曼光谱相比发生线型变化，使得 CARS 信号难以简单地被解释。而对于指纹区成像，由于 CARS 信号很容易被强大的非共振背景淹没，如何减轻乃至消除非共振背景干扰也是 CARS 成像所面临的一大挑战[15]。与CARS比较，受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)成像最大的优点在于没有非共振的背景，其光谱线型与自发拉曼光谱完全一致，因而 SRS 信号的分配和解释可以直接参考已经发表的拉曼光谱文献。两者均可以同时获得整个激发态谱，实现了生物组织的成像，但是需要可调谐脉冲激光器探测样品中的不同分子，因此很难将激光有效地耦合和同步到手持或便携式术中设备中。

空间偏移拉曼光谱(spatial offset Raman spectroscopy,SORS)提供了一种对深部组织样品进行非侵入性研究的方法[16-17]，其具有抑制表层成分拉曼光谱和荧光背景干扰的能力。光谱探测位置与激发光入射位置不同，当激光入射到样本表面并透射入表层物质内部时，其中一部分散射光子经过多次散射后达到组织深层, 并与深层组织成分发生拉曼散射,携带深层组织物质信息的拉曼散射光子在探测位置进行分析[18]，目前已有研究[19-20]将SORS用于检测假酒、评估骨成分以及分析乳腺癌组织中的微钙化等方面。将羟磷灰石、单水草酸钙以及 3.5% 碳酸盐置入8.7 mm 厚的鸡乳腺组织中，采用SORS检测正常乳腺组织下的癌症边缘，证实了拉曼光谱检测新鲜乳腺组织内微钙化灶的可行性。最近一些科学家将SORS与SERS的优点相结合用来检测深部样本的拉曼信号，NICOLSON等[21]采用便携式拉曼光谱仪检测埋于组织中的三维乳腺肿瘤模型，结果表明其跟踪乳腺肿瘤的深度达25 mm,为临床应用奠定了理论基础。

2 拉曼光谱在乳腺癌细胞系中的应用

乳腺癌很可能转移到骨骼、中枢神经系统和内脏，导致预后不良和总体生存率降低[22-23]，因此通过乳腺癌的拉曼光谱特点早期发现乳腺癌可降低乳腺癌患者的病死率。研究者[24-25]运用拉曼光谱、原子力显微镜(AFM)、光学显微镜探索正常乳腺细胞系(MCF-10A)与乳腺癌细胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)之间的差异与联系，采用主成分分析法(principal component analysis,PCA)分析拉曼光谱，得出正常乳腺细胞系(MFC-10A)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)的拉曼光谱主要波峰为苯基丙氨酸带、酰胺Ⅰ和Ⅲ带、CH2变形、CH2摆动/扭转和S-S键振动带。在2种乳腺癌细胞系中，酰胺Ⅰ、CH2变形带的强度类似，但是乳腺癌细胞系MDA-MB-231有较强的CH2变形带，运用这些波峰特征可以有效地区分3种细胞系，为拉曼光谱诊断乳腺癌奠定基础。

指导恶性肿瘤治疗的2个重要指标是“肿瘤反应”和“疾病进展”。肿瘤反应是指在治疗早期对治疗效果进行评估，疾病进展为癌症的增长和扩散，代表治疗失败。肿瘤进展包括多种机制，其中基质、血管生成、炎症、免疫系统、激素和外源性生物制剂发挥着重要作用，所有这些机制均会引起组织生化水平的变化[26-28]，因此识别癌组织的生化变化可以评估肿瘤的转移潜能、侵袭性和疾病进展，有助于制定治疗决策。MARRO等[29]发现：乳腺癌细胞趋向性与氨基酸、线粒体信号水平降低有关。MIGNOLET等[30]在MCF-7细胞内发现了4种使胞内脂类增加的多酚，并且其与细胞凋亡有关。研究[31-32]显示：乳腺癌的远处转移与细胞表面糖脂和糖蛋白的唾液酸化有关联。ABRAMCZYK等[33]发现：随着细胞侵袭性增加，细胞核仁组蛋白乙酰化水平升高；甲基伸缩振动随着恶性程度增加，拉曼光谱发生蓝移。放疗是乳腺癌治疗手段之一，研究者[34-35]采用拉曼光谱研究辐射对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的影响，结果表明：拉曼光谱可评估细胞内糖原水平的变化，将其用于恶性肿瘤潜在标志物和对放射治疗耐药机制的研究。研究者[36-37]采用拉曼光谱研究了乳腺癌耐药性与HER-2基因过表达的关系，结果表明：拉帕替尼的耐药性与HER-2基因过表达有关，在HER-2基因过表达的细胞中脂类增加，蛋白减少；接受拉帕替尼治疗后，HER-2基因阳性的细胞中脂类仍在增加。在治疗过程中，研究乳腺癌组织的拉曼光谱变化，可以确定治疗方法是否有效、是否需要修改，并有助于确定临床研究中进展终点的时间。

3 拉曼光谱在乳腺组织中的应用

拉曼光谱对乳腺癌组织的研究经历了从体外到体内、从组织切片到新鲜组织的过程，正常乳腺腺体与病变乳腺组织拉曼光谱的差异主要集中在胡萝卜素、脂质和蛋白质。乳腺良性与恶性病变拉曼光谱的主要差异为胡萝卜素和脂肪酸，利用酰胺Ⅰ和CH2弯曲振动的比值作为鉴别参数，可以区分正常乳腺组织和恶性乳腺组织。恶性组织特点为脂类含量下降、核酸和蛋白增加及结构紊乱(分子氢键断裂)。 研究[38-40]显示：类胡萝卜素的拉曼光谱是恶性肿瘤表现出的关键特征；癌前病变、导管内癌和浸润性癌组织中，DNA 的磷酸骨架伸缩振动谱线的特征峰蓝移至1 086 cm-1，说明在癌前病变组织中部分DNA 的单双链断裂。

正常乳腺组织与良、恶性病变组织的拉曼光谱特征为胡萝卜素、脂类、核酸和蛋白质含量不同，但目前研究主要集中于组织切片，并且均未构建合适的模型区分正常组织、良性病变和恶性病变。HAKE等[41]在2002年采用共聚焦显微拉曼光谱仪检测了乳腺组织的冰冻切片，通过拟合来源于细胞质、细胞核仁、脂肪酸、胶原蛋白、羟磷灰石钙、草酸钙、脂质和水的光谱，构造形态/化学乳房组织模型；通过以上实验构建的拉曼光谱脂质和胶原蛋白拟合系数，区分乳腺良、恶性病变的灵敏度为94%，特异度为96%。GEBREKIDAN等[14]构建的模型诊断乳腺癌的灵敏度为99.15%，非乳腺癌病变的特异度为90.4%，在含有恶性病变的组织内发现恶性成分的灵敏度为100%。但既往研究中实验标本均进行了预处理，如冰冻、甲醛固定、石蜡包埋和脱蜡等，这些预处理会影响组织拉曼光谱信号，因此检测未进行任何处理的新鲜在体组织的拉曼光谱非常必要。HAKA等[41]检测了9例保乳术患者的手术切缘，利用之前构建的数据模型进行诊断，检测阳性切缘的灵敏度为100%，特异度为100%，总准确率为93.3%。SHIPP等[42]探索多光谱组织病理学判断保乳手术切缘的应用，多光谱组织病理学利用自发荧光显微镜高空间分辨率、速度、敏感性(低特异性)结合高化学特异性的拉曼光谱可发现微小肿瘤，灵敏度达91%，特异度达83%。证实了拉曼光谱在体内检测可以实现，但是由于绝经前后乳腺组织脂肪含量变化和化疗对乳腺组织的影响，仍然需要构建更成熟的模型，以乳腺组织拉曼光谱特征为标准构建模型，可快速、客观、准确地鉴别乳腺癌组织、良性病变组织与正常组织。

保乳手术中准确地判断阴性切缘并区分良、恶性组织非常重要。拉曼光谱可以提供组织的化学性质和疾病发展状态等信息。在探索性手术中通过拉曼光谱判断病变的性质，可以降低二次手术率。拉曼光谱可以提供与传统病理类似的图像，结合拉曼光谱的穿刺活检技术可以提供即时、无需标记且客观的化学信息。研究[43-46]显示：利用建立的拟合系数模型，可成功地识别组织的良、恶性，在体内测量的准确率可达93.3%，光谱活检穿刺测量为实时诊断奠定了基础。

拉曼光谱技术不但可以应用于乳腺癌的诊断，还可以用于研究疾病进展及化学通路，为更好地理解疾病和治疗疾病提供生化信息。研究[40,47]显示：癌组织与正常组织中脂质构成比存在差异，对照脂质成分的拉曼光谱可以发现非癌组织的脂质多为油酸(油酸及其衍生物是脂肪组织中甘油的组成部分)，而癌组织中多为花生四烯酸(AA)(不饱和脂肪酸)。这一变化表明代谢是通过环氧合酶(COX)途径进行，不是通过脂氧合酶(LOX)进行，而LOX会导致二十烷酸类化合物参与炎症过程[48]。COX催化生成环状化合物，LOX催化生成非环状化合物。AA先于二十碳酸及其衍生物合成，其生物活性大于同型亚麻酸(DGLA)和二十碳五烯酸(EPA)。随着组织恶性程度增加，OH-NH-CH的光谱增强，代表重要生物分子(如核酸、蛋白、脂肪)的增加，位于600～1 600 cm-1(与核酸有关)的拉曼波峰也会发生改变。这些波峰的改变有助于对乳腺癌进行分级分期，高级别导管原位癌的脂肪酸和甘油的拉曼光谱增加而低级别则减少[48]。

癌症的具体病因并不明确，老化、氧化和自由基可能是其原因。BROZEK-PLUSKA等[38]对44例患者新鲜手术标本(肿瘤组织、健康组织和血管标本)进行分析，在获得的321个光谱中发现正常乳腺组织中类胡萝卜素和脂质的峰值明显；但是恶性肿瘤组织荧光干扰较强。在恶性肿瘤中类胡萝卜素和脂质峰值降低表明这些成分在恶性组织中的含量较低，类胡萝卜素减少可能由于脂褐素氧化，而脂质减少也可能为脂质过氧化。

4 展 望

利用拉曼光谱分析生物样本仍然存在很多挑战与局限性。样本的拉曼光谱信号较弱时可使用SERS等灵敏度较高的技术，但样品制备起着重要的作用。在分析生物样品的拉曼光谱时，由于成分复杂，需要建立可靠的校准模型确保可靠和定量测量。此外在使用探针进行体内分析时也存在挑战，在引入拉曼光谱作为诊断依据之前，需要克服背景荧光、伪影和信号弱等不足，且需要通过多元统计分析方法构建诊断模型。

拉曼光谱可以在分子水平上分析疾病的变化，为疾病诊断和治疗效果评价提供客观和可量化的信息。使用拉曼光谱技术可以更加深入地了解浸润性乳腺癌的浸润过程，获得的化学信息可以定量定性地分析疾病。荧光等干扰给生物样品拉曼光谱的获取和解析带来了巨大的困难，因此仍然需要开发获取、处理和分类数据的技术，通过对原始数据进行预处理，消除不需要的信号，增强拉曼光谱特征实现数据的定性和定量分析，从而判断乳腺组织的病变性质。随着拉曼光谱数据库、组织分类方法和仪器设计的不断改进，获取分辨率和准确度更高及采集时间更短的拉曼光谱数据将成为可能，从而实现癌症早期诊断，避免不必要的活组织检查，即时、快速判断乳腺癌保乳术的手术切缘，保证完全切除肿瘤。