动物源性食品中致病微生物的快速PCR 检测

崔荣飞，杨 洁，甄 理，张彩云，刘 伟，曹 楠

（1.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心 050041；2.河北省动物卫生监督所 050000；3.石家庄市藁城区畜牧工作总站 052160）

动物源性食品(Animal Derived Food)是指全部可食用的动物组织、蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品以及相关副产品等。 随着人民生活水平日益提高，动物源性食品已成为国民饮食结构中的主要品种和重要营养来源。 我国在全世界范围内属于动物源性食品的生产大国和消费大国， 同时动物源性食品的质量安全关系到人民群众的身体健康， 引起全社会的普遍关注和相关从业者的广泛研究。 动物源性食品的质量安全问题主要集中在：农兽药残留问题、环境污染问题、加工和销售过程中污染和添加，其中涉及到化学危害和生物危害等。 而在日常食源性疾病中， 由致病微生物引发的食物中毒或其他疾病是全球范围内食品安全面临的主要风险， 而动物及动物源性食品是食源性致病微生物的主要携带者之一。 因此，科学家和相关从业者一直致力于动物源性食品中致病微生物检测技术的研究和开发。 传统上，致病微生物的检验方法主要是生物培养及鉴定，操作复杂、周期长、要求微生物实验室条件进行，远不能满足及时准确检测、高敏感性和特异性的现实需求。 随着分子生物学技术研究的深入，微生物的分子生物学检测技术也在不断发展，其中PCR 技术因其极高的特异性、 灵敏度和可靠性已经广泛应用于医学检验、 食品检测及其他与DNA 或RNA 鉴定相关的领域，该方法快速准确，特别适合病原微生物的检测，尤其是在今年的新冠疫情中全世界广泛开展的核酸检测， 展示了快速PCR技术在检测领域的强大优势。 本文就动物源性食品中致病微生物的PCR 检测技术做以简单概述，抛砖引玉，希望引起更广泛的思考和研究[1-2]。

1 常规PCR 技术

PCR 即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），最早提出于二十世纪八十年代，是一种体外扩增特异性DNA 片段的手段。 其本质上是利用分子生物学技术，在PCR 仪中模仿DNA的天然复制过程，通过特定靶序列设计特异性引物，达到复制某一指定片段的目的。 PCR 反应步骤包括变性、退火（复性）和延伸三个阶段，只要在反应体系中提供足够多的碱基，并重复循环基本过程的这三个步骤，就可以获得更多的“半保留复制链”，每次复制出的新DNA 链又作为下次循环的模板，几个小时内指数性增长，将待扩目的基因扩增至几百万倍。 由于在所有细菌中编码rRNA 的一些基因序列保守性很强，因此可以用PCR 扩增其相应的DNA 片段，以此快速灵敏的检测动物源性食品中是否存在某种致病菌，应用PCR 技术检测微生物，首先要提取靶DNA，即通过离心、 过滤或简单培养的方法从动物源性食品中获取细菌细胞，然后将细胞裂解，进行核酸纯化使其适合进行扩增[2-3]。

由于传统PCR 技术出现最早，发展到现阶段相关技术非常成熟， 相关产品和配套也比较丰富， 是接受度和应用最广泛的PCR 技术。

2 多重PCR 技术

常规PCR 开始被提出时，单个反应体系只能特异性扩增一段DNA 序列，因此只能检测单一致病菌。 但实际应用中我们常常需要针对目标被测物检测多种致病微生物， 多重PCR（multiplex PCR）的出现满足了这一需求。多重PCR 与常规PCR 原理和反应过程是相同的， 但是该技术通过在一个反应体系中针对不同的DNA 或RNA 序列设计多对特异性引物，通过优化避免几个序列间的交叉反应和干扰， 实现了一次PCR 反应扩增多条目的DNA 片段，达到单次实验检测多种致病微生物的目的。

多重PCR 的优点有：效率高，通过一次PCR 反应扩增多条目的DNA 片段，实现单次实验检测多种致病微生物；实用价值更大，检测工作实际中常需要对一组常见致病微生物进行筛查，或通过单一致病菌的多个特征序列检测对被测物进行更准确鉴定；成本降低，通过减少测试次数，大幅度节约检测的时间成本和经济成本，有利于推广应用[4]。

多重PCR 技术在致病菌检测方面的有两个方向。 一是单次实验鉴定单一致病菌。 在一个多重PCR 反应体系中真对致病菌选取多个保守序列设计特异性引物， 通过多个特征位点的检测鉴定提高真确度，减少假阳性。 Kim S 等在临床上利用多重PCR对沙门氏菌检验分型。 蔺芳等根据Genbank 中PRV 的gB、gE、TK 基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA 进行多重PCR扩增及反应条件优化,快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒。 二是单次实验检测多种病原菌。 这种方法具有更广泛的应用价值，通过单一扩增反应体系中对多种微生物的检测，达到降低成本、简化操作又兼顾特异性和高敏性的目的[5]。 熊苏玥等在2019 年利用多重PCR 对食品中单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、 沙门氏菌以及霉菌开展同时检测，5 种致病微生物在20h 内的检出限均可达到100CFU/25g。 秦文彦等在2018 年通过优化主要影响因子, 研究建立了产黄曲霉毒素真菌及其潜在饲料或食品污染的多重PCR 快速灵敏检测体系。

3 实时荧光定量PCR 技术

实时荧光定量PCR （qPCR） 于1996 年被提出， 即在一个PCR 反应体系中引入荧光标记物， 让PCR 技术开始具备定量的能力，堪称一次技术飞跃。 经过不断发展，实时荧光定量逐渐成为一种基础技术手段， 与各种不同的PCR 技术结合发展出各类其他荧光定量PCR 技术，因其特异性更强、不易污染、自动化程度高的优点，得到越来越广泛的应用。实时荧光定量PCR 通过在反应中加入特异性探针对PCR 产物进行标记跟踪， 加入的探针携带有荧光标记，监控设备检测荧光标记，既可以实时了解反应过程，也可以更直观的对产物进行分析，利用专业软件对扩增结果进行计算，得到样品中目标被测物的初始浓度，从而实现较为简便的定量检测[6]。

荧光定量PCR 有荧光染料掺入法和探针法两种常用方法。荧光染料掺入法是把过量的荧光染料加入PCR 反应体系中，反应开始前此染料不会发光， 在反应过程中部分荧光染料会特异性地掺入DNA 双链，开始发射荧光信号，随着反应进程的持续，荧光信号的增加与PCR 产物的扩增同步， 实现对反应进程的监控。 探针法是指在一个PCR 反应体系中加入携带有荧光基团的特异性探针， 这个寡核苷酸探针包括一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 反应开始前，完整探针不向外发射荧光信号，扩增开始后， 探针随DNA 扩增被同时酶切分解为两个独立基团，使报告荧光基团发出的荧光信号无法被淬灭荧光基团吸收，相应的荧光信号就被监控系统接收到，重复这一过程，就能使每一条扩增的DNA 链与荧光分子形成一一对应关系，通过观测荧光信号累积达到实时定量目的[7]。

实时荧光定量PCR 技术经历了二十多年的发展，已经被广泛应用于各类传染性疾病的临床诊断和疗效评价，禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟等动物疫病病原菌和抗体检测，食源微生物、食品过敏源、转基因研究等食品安全领域[8]。 何苗等在2016 年使用实时荧光定量PCR 和双歧杆菌属及种特异性引物对收集的婴儿粪便中的双歧杆菌属及人体肠道特有的8 个双歧杆菌菌种进行定性及定量分析。 章沙沙在2016 年设计并优化实时荧光定量PCR 反应体系，建立了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌和副溶血弧菌六种食源性致病菌的实时荧光定量PCR 检测方法， 并通过食品样品的检测和传统方法验证，证明该方法具有良好的重复性和准确性。

4 环介导等温扩增反应（LAMP）技术

PCR 方法操作起来较复杂，其对温度控制的较高要求令试验过程对仪器和人员都提出较高要求， 不适合基层或现场快速诊断，2000 年日本学者提出了环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术。其独特优势使得这项技术在短短几年间被成功应用于多种疾病的检测中， 如SARS、禽流感、HIV 等。 该技术通过针对目的基因的6 个不同区域，分别设计一对外部引物和一对内部引物进行识别， 极大增加了目的DNA 片段的特异选择性，降低了交叉反应和干扰率。 LAMP 最大的优势是整个反应体系在等温条件(63℃左右)下进行，且反应时间缩短至30～60min[9]。 LAMP 方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，还对操作和仪器设备的要求降低了，因为LAMP 技术不需要传统PCR 技术中升温和退火的温度变化过程， 只需要借助特殊的链置换DNA 聚合酶就实现了等温条件下扩增降低了对昂贵、精密实验仪器的需求，简单的控温水浴锅或恒温箱就满足实验条件。 LAMP 反应过程产生大量焦磷酸镁沉淀，这是一种白色副产物，能造成反应体系溶液的浑浊，因此反应结束后即使不经过凝胶电泳，只使用浊度计或肉眼观察也能够判断结果，相较传统PCR 技术更具有简便性和易操作性， 是较为理想的快速检测方法。 LAMP 方法在反应进程中不能开盖操作，否则易造成气溶胶污染，导致假阳性结果[10]。

LAMP 技术通过20 年的发展，在医学诊断、流行病学、食品检测和兽医领域都得到了大范围推广和广泛应用。国内在LAMP技术方面的研究起步较晚，黄朱梁等在2015 年针对食品中单核细胞增生李斯特氏菌建立了基于LAMP 技术的实时浊度检测方法， 该方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32CFU/mL,可在60min 内完成扩增反应。 李佳桐等在2014 年根据GenBank 公布的沙门氏菌高度保守的STN 基因序列设计引物，优化和建立了沙门氏菌的LAMP 检测方法，最低可检出浓度为101CFU/mL。

5 重组酶介导等温核酸扩增技术（RAA）技术的应用

近几年国内出现了一种分子生物学新技术， 即重组酶介导等温核酸扩增技术 （Recombinase Aided Amplification）， 简称RAA。 该技术利用从细菌或真菌中获得的重组酶，能够在恒定常温 （39℃） 条件下实现核酸的快速扩增。 该重组酶首先与引物DNA 紧密结合，以酶和引物的聚合体形式在模板DNA 上进行搜索，当发现完全匹配的互补序列时，反应体系中的单链DNA 结合蛋白开始发挥作用，帮助打开模板DNA 的双链结构，然后在DNA 聚合酶的作用下开始序列复制扩增，最终形成新的DNA 双链，通过周期性重复反应过程使扩增产物以指数级增长。 结合荧光即时检测， 实现5～20min 输出结果， 灵敏度达到10copies/测试，该方法对环境温度、操作技能和实验设备要求更低，具有很大发展优势。

重组酶介导等温核酸扩增技术提出的时间较短， 且尚未形成一定应用规模，因此应用实例和相关报道也不多，李婷在2019年针对血吸虫病诊断的敏感性、特异性及可操作性的需求,基于重组酶介导的等温扩增技术原理建立日本血吸虫特异性基因片段RAA 快速检测方法，初步研究表明,建立的荧光RAA 法可用于血吸虫不同样品的检测，且在保持特异性良好的同时,检测敏感性较基础法提高了100 倍。 魏莹等在2018 年基于RAA 荧光法建立优化了溶血性链球菌检测方法， 并生产了相关快速检测试剂盒产品。

6 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）技术的应用

重组酶聚合酶扩增技术(RPA),因具有比传统分子及免疫学检测技术如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附技术(ELISA)等更快速、灵敏、特异、简便以及实用性强等方面优势, 现已在一定程度上得到应用。 RPA 反应的最适温度在37℃～42℃， 无需变性， 在常温下即可进行。 这无疑能大大加快PCR 的速度。 此外，由于不需要温控设备，RPA 可以真正实现便携式的快速核酸检测。 RPA 既可以扩增DNA 也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA 合成步骤。 RPA 技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA 结合蛋白(SSB)和链置换DNA 聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右[11]。

重组酶介导等温核酸扩增技术也是最近几年开始兴起的新技术，目前在国内应用不多，在致病微生物方面的报道更少。 王金凤在2018 年基于LMhlyA 基因保守序列， 建立并优化了单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA 检测方法；刘立兵在2018 年根据蜡样芽胞杆菌保守基因16S RNA 设计特异性引物， 建立了可用于食品中低浓度蜡样芽胞杆菌检测的real-time RPA 方法。

7 总结

随着分子生物学的不断研究， 针对动物源性食品中致病微生物检测的PCR 方法一定会不断发展和更新, 并时刻发生着技术进步，回想十年以前，常规PCR 技术还属于检测领域的先进技术，现在已经非常普及，更是出现了如LAMP、RAA、RPA 等等温核酸扩增技术，可以算得上是PCR 技术领域的一次技术革命，伴随着这次技术浪潮的推进，我们也要与时俱进，努力学习应用新技术，以更具活力的状态完成我们的检测任务。