基于生物热力学的不同产地柴胡抑菌活性评价

赵艳丹,胡相卡,马 悦,史淑丹,郑 岩,邢炳权,刘雅茹,孙玉琦,代春美

(锦州医科大学,辽宁锦州 121001)

柴胡为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根。现代药理研究表明,柴胡具有解热、抗菌、抗炎、保肝、抗病毒、抗肿瘤等作用,柴胡水提物对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用[1-3]。柴胡皂苷(Saikosaponins,SS)是柴胡主要生物活性成分和化学指标,柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是有效活性成分,为其重要的质量评价指标[4-6]。但是,中药的指标成分不一定为有效成分,即使为有效成分,它的含量与药效也不一定有直接联系。检测任何一种或几种成分均不能反映其整体疗效。

微量热法为生物热力学的主要研究手段之一,可测定生物机体在中药材等作用下生长代谢过程的能量转移和热变化,通过获得的热力学信息,可以实时、连续、在线监测生物体的生长代谢情况及在药材作用下的变化情况,从而表征药材对生物机体的生长代谢影响。该方法具有灵敏、普适性好、准确、在线、实时、动态的特点,已在很多领域得到应用[7-10]。热力学理论则反映了整体观念,生物活性检测与化学含量测定相比,具有更大的优势。

金黄色葡萄球菌可引起人和动物的多种常见疾病,随着抗生素类药物治疗细菌感染的广泛应用,取得疗效的同时,也带来了耐药性、过敏反应、毒性反应等诸多问题。为了克服这些弊端,世界各地的医药工作者渐渐地将研究重点转向天然药物,全球掀起了开发和研制天然药物的浪潮[11]。本研究以金黄色葡萄球菌为测试菌,利用微量热法,考察不同产地柴胡对金黄色葡萄球菌生长代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26001(批号26001-12a) 购自中国药品生物制品检定所;培养基:LB肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;不同产地的9批S1-S9柴胡药材 河北柴胡S1,山西柴胡S2-S5,陕西柴胡S6-S9;柴胡皂苷a对照品(批号110777-200507,纯度为93.2%)、柴胡皂苷d对照品(批号110778-200505,纯度为97.3%) 均购自中国药品生物制品检定所;乙腈、甲醇 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;氨水 分析纯,洛阳大学化学试剂;正丁醇 分析纯,山东旭晨化工试剂。

TAM Air微量热仪 瑞典Thermometric公司;L-2130型高效液相色谱仪 日本日立公司;L-2455DAD型检测器 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柴胡的HPLC 测定

1.2.1.1 标准品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a 10.36 mg和柴胡皂苷d 12.51 mg,置于25 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,得到含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的混合标准品溶液,用HPLC测定标准品。

1.2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取柴胡样品粉末(过四号筛)各10 g,8倍量水回流提取2次,每次1 h,合并提取液,浓缩,真空干燥得柴胡浸膏[12]。20 mL水溶解,饱和正丁醇萃取3次,每次60 mL,再用5%氨水洗2次,每次50 mL,分取饱和正丁醇液蒸干,甲醇溶解残渣并定容至10 mL,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜滤过,得柴胡供试品。

1.2.1.3 色谱条件 Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×46 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,水为流动相B,按表1条件进行梯度洗脱;流速:1.0 mL/min,柱温:30 ℃,检测波长:210 nm[13]。

1.2.1.4 方法学考察 经考察,样品的稳定性,仪器的精密度,方法的重复性良好,RSD小于2.0%,符合要求。分别取上述不同产地柴胡供试品溶液及标准品溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪,记录60 min内的色谱图,以峰面积计算柴胡药材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.2 柴胡微量热活性检测

1.2.2.1 供试品溶液的制备 按照1.2.1.2项下供试品溶液制备所得浸膏,以灭菌三次蒸馏水为溶剂,配制成1 g/mL的溶液(以柴胡药材计)。

1.2.2.2 微量热活性的测定 在 37 ℃,测定金黄色葡萄球菌生长代谢热谱曲线(空白对照组)。采用安瓿法,在净化工作台内,每个安瓿精确加入5 mL的LB培养基,接种金黄色葡萄球菌,菌接种量为1×106CFU/mL,加入一定量柴胡溶液,使各安瓿药液终浓度为2 mg/mL,混匀,加盖密封,放入微量热仪中。37 ℃培养,记录细菌的生长代谢曲线。

1.2.2.3 生物热力学参数 金黄色葡萄球菌的生长时间曲线,P1、P2、T1和T2分别是两个峰的最大功率和出峰时间,k是峰的最大生长速率常数,I为抑制率,tG为细菌传代时间。

计算公式如下:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0kt,其中P0是时间t=0的热流功率,Pt是时间t的热流功率[14]。由 tG=(ln2)/k得出不同条件下的细菌传代时间tG。细菌生长抑制率定义为 I=(k0-k1)/k0,式中k0为金黄色葡萄球菌在正常条件下的生长速率常数,k1为金黄色葡萄球菌在不同药物作用下的生长速率常数。I值越大,药物对细菌生长抑制作用越强。

1.2.2.4 色谱峰峰面积与抑制率I的相关性分析 为了进一步说明柴胡发挥抑菌作用的主要活性成分,本研究采用相关分析法,对9批次柴胡药材的6个共有色谱峰峰面积与抑制率I进行Spearman双变量相关分析[15-16]。

1.2.3 数据处理 实验重复检测3次,取其平均值。采用SPSS 20.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地柴胡HPLC分析

2.1.1 不同产地柴胡样品进行HPLC检测的谱图 根据1.2.1.3色谱条件,测定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,记录60 min内的色谱图。其标准品溶液谱图见图1(A)。确定了6个特征峰为共有色谱峰,见图1(B)。

图1 标准品溶液的HPLC色谱图(A)、 柴胡样品的HPLC共有色谱图(B)Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A), Common HPLC chromatogram of Bupleurum chinense(B)注:A为混合标准品,B为样品的共有峰;1～6号峰为共有色谱峰,其中3号峰为 柴胡皂苷a,4号峰为柴胡皂苷d。

2.1.2 不同产地柴胡HPLC检测共有峰的相对保留时间及相对峰面积 在柴胡的HPLC色谱图中,由于4号峰分离度较好,峰面积较稳定,保留时间适中,且为柴胡主要药理活性成分之一,故选定其作为参照峰,各共有峰的相对保留时间以及相对峰面积见表2～表3。

表2 不同产地柴胡HPLC图谱共有峰相对保留时间Table 2 Relative retention time of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表3 不同产地柴胡HPLC图谱共有峰相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peak in HPLC chromatogram of Bupleurum chinensis from different habitats

表4 柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量Table 4 Contents of saponins a,d in Bupleurum chinense

图2 不同产地柴胡对金黄色葡萄球菌生长代谢产热谱图Fig.2 Power-time curve of Staphylococcus aureus in Bupleurum chinense from different habitats

2.1.3 不同产地柴胡HPLC含量测定 根据HPLC检测的峰面积,计算柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,其结果见表4。结果显示,山西柴胡S3中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最高,河北柴胡S1中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量最低,山西柴胡和陕西柴胡中柴胡皂苷a和d的含量高于河北柴胡。

2.2 柴胡提取物的生物活性测定结果

2.2.1 不同产地柴胡提取物作用于金黄色葡萄球菌生长代谢产热谱图 金黄色葡萄球菌在不同产地柴胡作用下的生长代谢产热谱图(图2)。在相同的条件下,实验结果有良好的重现性。各产地柴胡作用于金黄色葡萄球菌的谱图形状相似,相对空白对照组,各样品最高峰的峰高、出峰的时间不同。

2.2.2 不同产地柴胡提取物作用于金黄色葡萄球菌生长代谢的热动力学参数 由金黄色葡萄球菌的生长代谢产热谱图(图2)获得不同产地的柴胡作用于金黄色葡萄球菌的热力学参数,如表5所示。与空白组相比,不同产地柴胡明显降低了金黄色葡萄球菌生长的最大发热功率P2,表明柴胡不同程度地抑制了细菌生长。抑制率I值反映了不同产地柴胡对金黄色葡萄球菌抑制作用的强弱。

表5 不同产地的柴胡作用于金黄色葡萄球菌的生长代谢热力学参数Table 5 Thermokinetics parameters of Staphylococcus aureus growth in the presence of Bupleurum chinense from different habitats

结果发现,不同产地的柴胡抑制率在7.14%～53.06%,山西和陕西柴胡抑菌活性高于河北柴胡。其中山西柴胡S3对金黄色葡萄球菌的抑制率I为53.06%,其值最大,抑菌作用最强。由生长代谢曲线可以看出,不同产地的柴胡作用于金黄色葡萄球菌的曲线相似,峰形后移,传代时间tG延长。说明生长代谢时间延长,也表明柴胡对金黄色葡萄球菌有抑制作用。其中,山西柴胡S3的传代时间为150.68 min,其传代时间最长,说明其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。

2.2.3 共有色谱峰峰面积与抑制率I的相关分析 采用SPSS软件对共有色谱峰峰面积与生物热力学参数抑制率I进行相关分析,其结果见表6。

表6 共有色谱峰峰面积与抑制率相关分析结果Table 6 Analysis results of correlation between peak area of common chromatographic peaks and inhibition rate

其中5个峰的相关系数R值均大于0.5,说明了这些成分与抑制率有较高的相关性。其中3号峰柴胡皂苷a的相关系数为0.783,4号峰柴胡皂苷d的相关系数为0.717,贡献度较大,显著相关(P<0.05)。说明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d与柴胡抑制金黄色葡萄球菌活性存在着密切的关联性。

3 讨论与结论

现有中药质量控制标准多为一个或几个活性成分的指标,但单纯的化学检测无法反映各成分与药效之间的关系。目前中药质量差异较大,中药药效物质基础研究思路倾向于药材及有效部位,有效单体作用的“分离解析研究”,而疏于“还原-整合”思想,影响了中药材的质量评价。以热力学理论指导的生物活性测定与传统化学成分测定相比,反映了中药整体的效应[17]。

柴胡皂苷是柴胡主要化学指标和生物活性成份,根据其化学结构可分为柴胡皂苷a、b、c和d等,柴胡皂苷a、d活性最强,研究最广。本研究以不同产地柴胡、柴胡皂苷为对象,基于生物热力学活性对柴胡的抑菌作用进行了评价。结果表明柴胡皂苷含量最高的山西柴胡S3抑菌作用最强。进一步通过相关分析表明,柴胡皂苷a的峰面积与抑制率有最高的相关系数,说明柴胡皂苷a是其生物活性起作用的主要物质。其次,柴胡皂苷d相关系数仅次于柴胡皂苷a,对柴胡的生物活性也起着重要的作用。

本研究对不同产地柴胡的抑菌作用进行了研究与分析,用热力学方法获得主要热动力学参数并与化学成分进行相关性分析。通过研究发现:将化学成分检测与生物力学评价相结合,构建综合的评控模式,有利于对药材进行更合理的评控[18-19]。通过HPLC色谱峰峰面积与生物热力学参数抑制率I的相关性研究,初步探讨了柴胡的活性成分,同时也为柴胡的质量控制提供参考。微量热法与传统的化学检测方法相比,体现了中药作用的整体性。更客观、全面地评价柴胡的生物质量,为中药药效物质筛选提供思路与参考,也为其它药材的质量评价提供新思路。