中空纤维膜三相液相微萃取法测定猪尿及牛奶中的盐酸克伦特罗

(泰州市食品药品检验所,江苏泰州 225300)

盐酸克仑特罗(clenbuterol,CLB)俗名“瘦肉精”,具有肾上腺素受体激动作用[1],2011年起,我国与墨西哥相继曝光了大范围“瘦肉精”事件,引起社会各界广泛关注。整顿办函[2010]50号文《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用食品添加剂名单(第四批)》中明确规定不得在养殖环节违法添加盐酸克伦特罗等(即牛羊猪等肉制品中不得检出瘦肉精)。针对于动物源性样品基质复杂性以及目标分析物含量较低等特点,样品前处理技术是决定所建立的检测方法成功与否的关键步骤。

Pedersen-Bjergaad等[2]于1999年将多孔的聚丙烯纤维膜与支撑液膜萃取原理结合,设置了一种简单、廉价、一次性使用的萃取体系,即中空纤维膜液液液微萃取(HF-LLLME)。HF-LLLME中最常用的聚丙烯纤维膜内径为600 μm、膜壁厚度为200 μm、壁上微孔孔径为0.2 μm、机械性能强、不降解、可耐受大多数有机溶剂。当对接受相体积要求较大时,可以将较长的中空纤维膜折成U型,两端直接与微量注射器连接,该种方式已被用于萃取环境样品中的有机汞形态[3]和生物样品中的抗抑郁药[4-5];杆状的中空纤维膜一端可以被封口以防止接受相流失,另一端连接微量注射器用于装载和抽取接受相[6];也可以两端都封口,萃取完成后,剪开一端抽回接受相[7-9]。此外,为了加快HF-LLLME的传质速率,超声辅助[10]等手段亦被用于HF-LLLME中。由于中空纤维膜膜孔可以阻止大分子化合物进入,HF-LLLME具有较强的净化基质能力,适于复杂基质样品分析。

关于液相微萃取技术用于瘦肉精分析的文献近年也有不少报道,丁芳林等[11]在2008年就探讨过采用单滴三相液相微萃取(single drop microextraction,SDME)的方式萃取猪尿中的盐酸克伦特罗,借助高效液相色谱-紫外检测器进行检测,该方法检出限为25 μg/L。LIU Baomi等[12]采用固相萃取和超声辅助分散相液液微萃取(ultrasonic assistant dispersive liquid-liquid microextraction,UA-DLLME)结合的双富集方法提取猪组织中的克伦特罗,用高效液相色谱-紫外检测器进行检测,高效的富集效率使得该方法检出限低至0.07 μg/kg。而HF-LLLME相对于上述SDME或是DLLME来说,具有操作容易掌握、更稳定的特点,已被广泛应用于元素形态分析[13]、环境污染[14]、法检研究[15]、药物分析[16]等领域。本文旨在建立一种绿色、经济、高效的中空纤维膜三相液相微萃取方法用于富集分离,高效液相色谱/紫外检测定量检测猪尿及牛奶中痕量盐酸克伦特罗的方法,期望将液相微萃取技术进一步拓展到复杂基质样品中痕量甚至超痕量目标分析物的分析检测中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪尿 取自于本地养猪场(江苏,泰州);牛奶 购买于本地超市;中空纤维膜 Q 3/2 Accurel聚丙烯中空纤维膜(Membrana,Wuppertal,Germany),其内径600 μm,膜厚度为200 μm,膜孔径为0.2 μm。将中空纤维膜剪成 4 cm的小段(其膜腔内大约可容纳12.5 μL的接受相),施加压力将其一端封口,并用丙酮超声清洗后晾干备用;盐酸克伦特罗(clenbuterol,CLE) 纯度为98.5%,购于德国Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈(色谱纯) 购于国药集团;甲醇(色谱纯) 购于美国MREDA公司;甲酸胺、甲酸、氢氧化钠、盐酸、乙酸、乙酸钠、甲苯(均为分析纯) 购于国药集团;β-葡萄糖酶醛甙酶/芳香基硫酸酯酶(β-Glucuronidase/aryl sulfatase;10000 U/mg) 购于sigma-aldrich。

Waters e2695液相色谱-2498型紫外检测器 美国沃特世公司;C-MAG-HS7磁力加热搅拌器 德国IKA公司;XS204万分之一电子天平 梅特勒托利多仪器(上海)公司;Allegra 64R 冷冻台式高速离心机 BECKMAN公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备方法

1.2.1.1 猪尿 将所取得的尿样适量分成四等份,分别为不加标、加入低、中、高浓度克伦特罗标准溶液(分别为5、50、500 μg/L),经5000 r/min离心20 min之后取上清液,经过0.22 μm滤膜过滤后,用0.1 mol/L NaOH溶液稀释2倍,用于后续萃取检测。

1.2.1.2 牛奶 前处理过程参考文献[17]和中华人民共和国国家标准GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》。称取5.00 g牛奶四份,分别为不加标、加入低、中、高浓度克伦特罗标准溶液(分别为5、50、500 μg/kg),于50 mL离心管中,加入100 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液,10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液,于37 ℃水浴中酶解12 h。取出,降至室温,加入10 mL乙腈,涡旋混匀,超声提取20 min,水平振荡5 min,10000 r/min离心10 min,取上层乙腈层于另一离心管中,下层水相再加入乙腈重新提取1次,合并两次乙腈层,加入5 mL正己烷,振荡5 min,4000 r/min离心10 min,移去正己烷层,向乙腈提取液中加入1.0 g 氯化钠,静止分层。将乙腈层溶液转移至鸡心瓶中,旋蒸至干,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液复溶。后经HF-LLLME萃取富集后测定。

1.2.2 中空纤维膜三相液相微萃取方法(HF-LLLME) 本实验中的HF-LLLME主要基于疏水作用和pH梯度来完成萃取的,阳离子型的目标分析物(如盐酸克伦特罗)会在强碱性条件下去质子化,以疏水性较强的分子形式存在,因此会被中空纤维膜的膜孔中的有机溶剂所萃取,而膜腔中的酸性接受相则通过使目标分析物质子化而将其反萃至接受相中,其克伦特罗分子结构及其萃取机理由图1所示。自制的HF-LLLME操作装置如图2所示,具体萃取过程为:将7 mL含0.1 mol/L NaOH的样品(pH约为12.8)放置于含有搅拌磁子的7 mL的样品瓶中,用25 μL平头注射器抽取12.5 μL的接受相(0.1 mol/L HCl),将中空纤维膜套在注射器的针尖端,并将其浸泡在甲苯中约3 s,取出待甲苯挥发完后将注射器内的接受相打入中空纤维膜的膜腔中,并将中空纤维膜浸泡在中间相(甲苯)中约25 s后,取出快速置于样品中开始萃取。萃取完成后移出注射器,抽回接受相用于后续HPLC-UV分析。

图1 盐酸克伦特罗分子结构 及HF-LLLME萃取克伦特罗机理Fig.1 Chemical structure of clenbuterol and mechanism of HF-LLLME

图2 HF-LLLME萃取装置Fig.2 The home-made hollow fiber based liquid-liquid-liquid microextraction apparatus

1.2.3 高效液相色谱-紫外检测方法色谱条件 Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温30 ℃;进样体积10 μL;流动相A为50 mmol/L甲酸铵溶液,用甲酸调节其pH为3.5,流动相B为乙腈,流动相A梯度如下:0～15 min(80%→40%),15～20 min(40%→40%),20～21 min(40%→80%),21～25 min(80%→80%)。

1.3 数据分析

本文原始数据均来自Waters Empower3,采用Origin 8软件进行数据分析及图表绘制。

2 结果与讨论

2.1 中空纤维膜三相液相微萃取方法条件优化

在本次HF-LLLME萃取过程中,有机溶剂的选择,给予相与接受相的酸碱介质及pH的改变以及采用动态萃取模式都会影响分配系数,从而改变富集倍数。另一方面,加大接触面积、搅拌也可以增加传质速度尽快达到萃取平衡。

综上所述,本实验直接选定0.1 mol/L的NaOH和HCl这两种强碱强酸作为本实验的给予相和接受相介质(后续不再对其进行优化)[16],对影响萃取效率的其他主要因素,包括中间相有机溶剂种类、萃取时间、搅拌速率以及盐浓度等进行了优化。

2.1.1 有机溶剂的选择 在HF-LLLME中,有机溶剂的选择是至关重要的,有机溶剂必须满足以下特点:与水不互溶,对所选目标分析物具有较好的萃取效率以及萃取重现性,同时应尽可能具有较小的传质阻力。考虑到盐酸克伦特罗分子结构中含有苯环且具有一定极性。因此有机溶剂考察了苯系物中的甲苯、苯乙醚及极性略大的正辛醇三种不同种类有机溶剂对萃取效率的影响,结果如图3所示,甲苯对其萃取效率最高,因此最终采用甲苯作为萃取中间相。

图3 有机溶剂种类对萃取效率的影响Fig.3 Influence of various organic solvents on HF-LLLME

2.1.2 萃取时间的选择 HF-LLLME是平衡萃取,萃取时间是影响萃取效率至关重要的又一因素。本实验考察了萃取时间在10～40 min之间对萃取效率的影响,结果如图4所示,10～20 min萃取效率显著升高,在20～30 min萃取基本达到平衡,30～40 min略有下降,推测其原因可能是聚丙烯纤维膜膜孔中的有机溶剂随着萃取时间延长发生不可逆扩散损失而导致,综上考虑,最终选择30 min作为萃取时间。

图4 萃取时间对萃取效率的影响Fig.4 Influence of extraction time on HF-LLLME

2.1.3 搅拌速率的选择 理论上,增加搅拌速率可以增大传质速率从而提高萃取效率,但是更高的搅拌速率可能会使样品溶液形成极其不稳定的湍流,从而使萃取过程不稳定,结果不重现,因此本文仅考察了搅拌速度在1000～5000 r/min之间对萃取效率的影响,结果如图5所示,在1000～3500 r/min之间,萃取效率随着搅拌速率增加而显著提高,在3500～5000 r/min基本达到平衡,为了兼顾萃取效率和萃取重现性,最终选择搅拌速度为4000 r/min。

图5 搅拌速率对萃取效率的影响Fig.5 Influence of stirring rate on HF-LLLME

2.1.4 盐效应考察 由于最终样品为尿样和牛奶,基质中盐成分较高,因此,本实验对盐浓度(1%～20% NaCl)也进行了考察,结果(见图 6)表明,在所考察范围内,盐浓度对CLB的萃取无明显影响,因此选择在给予相中不加盐。

图6 盐浓度对萃取效率的影响Fig.6 Influence of NaCl concentration of on HF-LLLME

2.2 方法分析性能考察

在中空纤维膜三相液相微萃取最佳条件下,即将不同浓度的克伦特罗溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中作为萃取的给予相,甲苯为中间有机相,12.5 μL 0.1 mol/L HCl溶液作为接受相,在4000 r/min的搅拌速度下萃取30 min,将10 μL最终萃取所得溶液进入高效液相色谱进行检测,考察了该萃取方法与高效液相色谱-紫外检测器联用下(HF-LLLME-HPLC-UV)方法的检出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)、线性范围、萃取相对标准偏差等分析性能参数,结果见表1。该方法在1.5～1000 μg/L范围内具有良好线性,线性方程为Y=3011.8X-7116.4(r=0.9980),方法的检出限、定量限分别为0.5和1.5 μg/L,可以看出,未经过HF-LLLME,直接进液相检测的检出限为100 μg/L,而经过HF-LLLME萃取富集后,检出限低至0.5 μg/L,使得HPLC/UV测定盐酸特罗的灵敏度提高了约2个数量级。

表1 HF-LLLME-HPLC-UV方法分析性能参数Table 1 Analytical performance of the HF-LLLME-HPLC-UV method

注:a:10 μL标准溶液进样方法(standard injection,SI)检出限(相当于HPLC-UV自身对克伦特罗的响应度);b:通过HF-LLLME萃取富集的方法(HF-LLLME-HPLC-UV)检出限。

表2 HF-LLLME-HPLC-UV方法回收率Table 2 Analysis of CLB in swine urine and cow milk samples by the HF-LLLME-HPLC-UV method

注:ND:未检出。

2.3 方法准确度及精密度

对牛奶、猪尿等样品进行了加标回收实验,在5、50、500 μg/L或μg/kg的添加水平下,采用外标法进行定量(标准曲线是一系列浓度标准物质配制在蒸馏水中进行HF-LLLME萃取后经HPLC/UV测定获得的),加标回收结果具体如表2所示,克伦特罗在牛奶中的加标回收率为80.2%～94.4%,相对标准偏差在2.7%～6.4%之间,在猪尿中的加标回收率为87.0%～102.4%,相对标准偏差在5.1%～9.8%之间。

图7、图8分别是猪尿和牛奶的实际样品分析色谱图与标准品分析图的对比,由色谱图可以明显看到两种现象:a.50 μg/L加标的猪尿及50 μg/kg牛奶样品不经过HF-LLLME,无法检测到CLB的峰(分别见图7(b)和图8(b));经过HF-LLLME富集后CLB峰型明显(分别见图7(c)和图8(c)),且峰高及峰面积都与10000 μg/L标准品色谱图峰(分别见图7(a)和图8(a))接近,说明本文中HF-LLLME显示出超高富集浓缩效率;b.经HF-LLLME富集后的猪尿样品色谱图杂峰明显少于未经HF-LLLME富集的(比较图7(c)和图7(b)),说明HF-LLLME净化基质能力显著,牛奶样品不明显估计是因为牛奶在预处理时已经将基质足够净化。

图7 标准品与猪尿样品分析色谱图比较Fig.7 The chromatograms of standard CLB solution and swine urine sample spiked with CLB

图8 标准品与牛奶样品分析色谱图比较Fig.8 The chromatograms of standard CLB solution and milk sample spiked with CLB

3 结论

本实验采用中空纤维膜三相液相微萃取与高效液相色谱-紫外检测法相结合,建立了一种高效、快速、经济、可靠的富集分离方法,可用于定性、定量分析猪尿及牛奶中的痕量盐酸克伦特罗。其中,HF-LLLME的应用极大的避免了生物样品中的基质干扰,同时起到高倍富集样品基质中的特定目标分析物(CLB)的效果,将HPLC-UV测定盐酸克伦特罗的检测灵敏度提高了约两个数量级,拓展了HPLC-UV在痕量甚至超痕量分析领域中的应用范围。