研究生教学中的基因克隆与病毒载体的构建

王菁华， 孙 瑾， 穆莉莉

（哈尔滨医科大学神经生物学教研室，哈尔滨150081）

0 引 言

基因克隆技术［1］是20 世纪70 年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，其最终目的在于通过相应的技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。病毒载体构建技术［2］是将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体［3］或是细胞培养中［4］，可应用于基础研究［5］、基因疗法［6］或疫苗［7］。基因克隆技术有着极其广泛的应用前景，在动物克隆［8］、植物克隆［9］以及疾病治疗领域［10］都有着很强的使用价值，也是各国研究投入的重点。

在广大医学院研究生日常实验科研中，基因克隆技术以及病毒载体的构建技术是其经常面对的实验内容。在研究生教育教学过程中，特别是在硕士研究生新生里，通过观察以及与学生们之间的交流反馈，发现对于硕士研究生新生来说存在两个需要积极引导解决的问题：①研究生新生还没有建立研究生学习应当具备的思维方式和思维习惯；②新生普遍缺乏相关实验实践经验。针对本校学生存在的问题，我校在硕士研究生一年级的第二学期开设了相关内容的选修课，课程的内容主要针对学生在实验中可能会遇到的相关实验技术，主要包括聚合酶链式反应（PCR）技术，组织化学和细胞化学技术，标记技术，分子杂交，细胞培养技术，电镜技术及应用，流式细胞技术，膜片钳技术及其应用和基因克隆与病毒载体的构建等。笔者在多年的基因克隆技术和病毒载体构建的教学中，累计教学260 人次，2018 ～2019 学年选修人数为80 人，共9 课时。如何做好理论与实践的衔接是近年教学中经常思考的问题。

1 教学指导思想

1.1 案例化教学的思考

案例教学是连接教育理论与教育实践之间的桥梁［11］，案例化教学在研究生教育阶段有着其独特的优势。首先，从理论向实践的转型，离不开典型案例的示范作用，多年的教学实践表明，有效开展案例化教学模式必须要注意：①对于案例的选取要典型全面；②在随堂教学中要注意师生互动，问题的积极引导；③考核的方式方法要密切联系学生学习中遇到的问题。把握好核心问题，有针对性地选择教课内容，针对教授对象的实际实验需求，设计教学大纲，以期达到最好的教学效果［12］。

1.2 PBL教学模式的思考

研究生教学相比义务教育、本科教育，有着很大的不同，它不是简单的“填鸭式”教学，也不是大规模的机械化教学，其教学的目的在于培养学生发现问题、思考问题、解决问题、实际应用的能力。正确的方法论对于问题的解决将会是事半功倍的。在教学中，坚持以问题为导向，根据问题，设问抛问，为学生们确定研究问题的方向，其后学生们通过自我学习，而后随堂展示，发现自学中存在的问题，老师再根据学生的学习反馈，针对性地做出引导，最后达到问题的解决和学生们知识的应用掌握。这种教学方式是近些年在国内外的中小学教育及本科生教学中受到广泛的重视，称之为基于问题的学习（Problem-Based Learning，PBL）［13］。在改革之前通用的教学模式是：学生课前预习，老师备课，老师授课，课后习题巩固复习。对比起来，二者各有利弊：原始的教学模式优点在于对知识的普及教授，缺点在于学生们更多的是被动记忆消化，不能够有效地激发学生对于问题的解决思考能力。而在中小学义务教育阶段开展教育改革，可以激发一部分同学的学习积极性，但是在当前的教育大环境来看并不能做到环环相扣，造成的结果却是大部分义务教育阶段学生没有打下良好的知识基础，反而把问题留给了之后的教育教学者。PBL教学模式似乎不适合初级学习的学生，但是对于处于高级学习阶段的硕士研究生来说，应为利大于弊：①研究生教学属于精细化教学，小班教学。导师在开展教学工作时精力足够照顾每一位学生，便于因材施教。②脱胎换骨于本科生教育，研究生普遍具有良好的学习能力和学习习惯，问题的理解能力与解决能力已打下了一定的基础。因此，开展PBL教学模式可以取得较好的效果。

2 教学内容与授课模式

“基因克隆”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。基因克隆技术［14］，又称重组DNA技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA 后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。本门课程意在通过问题导向，联系硕士研究生在今后实验中可能遇到的有关基因克隆技术的相关问题，使研究生在了解生物学以及分子生物学的基础知识后，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的原理。根据教学的实际情况，将所要教授的相关内容划分为8 个学时4 大分类，每个分类占用2 课时，分别是：①基因克隆原理及载体图谱的识别；②Vector NTI 及相关软件的应用；③蛋白标签在基因克隆中的应用；④病毒载体的构建及应用。由于基因克隆技术相关知识点庞杂，对于零基础的同学来说，理解与学习起来都较为困难，因此，结合多年来的基因克隆实验经历，教学中坚持由浅入深，由简入难，抛问设问的教学方式，用通俗易懂的方式讲解知识点。从最基本的知识如阅读质粒图谱pEGFPN1，pQCXIP，pCMV-Tag2B，pLVX-AcGFP-N1 等开始讲起，并且把笔者所克隆过基因的过程如Ostn，Bex1，RGS5 等一一逐条讲解。每个克隆质粒的案例都包括基因的背景，明确克隆目的，选择适合骨架质粒，查找目的片段，选择酶切位点，设计引物，获取目的片段，胶回收，酶切，连接转化，验证阳性产物等内容［15］。通过案例分析教学，引导学生养成逻辑化的思维习惯，在结合当前基因克隆技术前沿发展动态，着重讲授难点知识——构建病毒质粒，包括慢病毒、腺病毒、逆转录病毒的选择、包装及其他应用性较强的知识。通过理论联系实际，紧抓前沿发展态势，让学生们对于基因克隆技术有了更立体更系统的认识。对于部分对基因克隆技术有了实验经历的研究生，通过再一次的动手实验讲解，转换立场的方法，使得他们对于基因克隆技术有了新的认识，在授课过程中，能够和老师积极的就其实验中所遇到的疑惑点进行讨论学习。其次，基于学生们的教学需求，在8 课时的教学大纲之外，还邀请了对于基因克隆技术感兴趣的同学去相关实验室参观学习，面对面地了解熟悉基因克隆实验的全流程。通过多种多样的教学方式，立体的展示了基因克隆技术，希望能够为硕士生们的研究之路开一个好头。

3 考核标准与考核方式

对于本门选修课程，在学校要求的考核框架下，本课程采取考勤＋结课测验的方式来对学生的掌握情况进行测试。只要认真听课的同学，最后都会给予合格的基本成绩。在结课时组织随堂测验，以期对学生们的知识掌握情况进行掌握，题目如给出两个质粒的图谱，根据图谱回答该质粒可以选择哪种酶切，具有什么原核抗性、真核抗性，是否可以用于包装病毒、可以包装哪类病毒等。通过测验结果来看，学生们对于知识能够有很好的消化吸收，达到了本选修课的教学目的。

4 授课反馈与总结

在最后一课上，同时向学生们征求意见，对于学生们在课程中的疑问，以及对于课程和教学上好的建议与意见进行收集与总结，主要集中总结在以下几个方面：

（1）在基因克隆技术方面。学生们提出了一些具体问题，如：如何进行细胞基因敲除，如何进行甲基化测序，引物如何选择，引物扩不出基因的原因，如何构建基因数据库，如何建立稳定克隆等，以及基因重组的其他具体问题。

（2）病毒载体构建方面。问题包括如何选择病毒载体，转染过程中有哪些注意事项，如何提高转染的效率，载体技术在医疗上的应用情况，如何进行病毒的稳定克隆，慢病毒的不稳定问题，病毒的选择以及特定病毒的不足处，病毒载体构建时的问题和解决办法。

（3）对于课程建设的建议与意见。①对于课程的设置，学生们还是认为基因克隆技术相关课程知识较多，选修课的时长较短，不利于知识的理解与衔接，建议对于实用性较强的病毒载体的构建部分课程独立出来，单独设立一门选修课；②有的学生认为先理论教学没有实践操作的体验，不利于知识的消化应用，建议除了讲授理论知识外，开设基因克隆的实验辅导班，从而真正动手学习实验的操作；③课程教学应当遵循由浅入深的原则，通过循序渐进的教授方式，便于学生们更好地消化吸收相关内容；④要加强师生之间的随堂互动，老师积极地设问抛问，学生积极思考，良性互动能够调动学生们的学习积极性。

5 结 语

作为医学领域教学，如何做好研究生教育教学与本科生教育教学的衔接工作，使硕士研究生新生们能够用最短的时间进入研究生学习的学习状态，掌握基本科研素养，专业技术知识，是研究生教育阶段的一个重要工作。而开设实验技术方面的选修课程可找到一个符合实际的选择。在今后的教学工作中不断改进、完善基因克隆与病毒载体构建的课程，以教为辅、学为主，充分激发学生学习的积极主动性，从提高学生的科研能力和水平入手，培养学生的科研兴趣，为研究生日后的实验室科研工作奠定坚实的基础。