基于生物信息学分析结合RT-PCR检测的肝细胞癌组织中miRNA表达变化及意义

冯青青，赵文文，赵文飞，于文静，闫文娴，魏红梅

青岛市中心医院，山东青岛266000

肝细胞癌(HCC)是临床常见恶性肿瘤，2012年全球有782 500例新发患者和745 500例死亡患者[1]。HCC早期症状并不明显，易被忽视。大多数HCC患者确诊时已是晚期，因此病死率高[2,3]。近年来，有关HCC预后标记物的研究一直是热点与难点。微小RNA(miRNA)在HCC发生发展过程中表达水平有变化，在HCC的筛查和诊断、治疗方案选择、预后分析方面具有指导意义[4,5]。临床甲醛固定石蜡包埋(FFPE)标本是进行医学回顾性研究的最佳资源。虽然新鲜标本经过固定、脱水、浸蜡、包埋后，miRNA部分已降解或修饰，但miRNA因其体积微小，故可在FFPE组织中保存，与新鲜组织样品中miRNA表达相差无几[6,7]。本课题组前期利用PubMed Central文献检索，深入分析miRNA在HCC组织中的差异表达，发现智人(hsa)-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p在HCC细胞系及组织中呈高表达，并与HCC发生密切相关，二者可作为HCC的潜在生物标记物[8～20]。2018年2月，本研究检索癌症基因组图谱(TCGA)数据库、高通量基因表达(GEO)数据库，并用RT-PCR检测本院76例HCC及其癌旁组织中hsa-miR-191-5p与hsa-miR-221-5p的表达，探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料 生物信息学分析资料来源：取GEO数据库中GSE12717芯片集，其中包含8例HBV感染的HCC患者样本和4例正常无肿瘤对照样本，GSE10694芯片集包含78例HBV感染的HCC患者样本和配对癌旁样本。RT-PCR检测标本来源：2016年2月～2018年2月本院肿瘤综合治疗二科确诊的HCC患者76例，取其HCC组织标本及其癌旁正常组织(距肿瘤边缘>3 cm)，均为初治，HBV阳性。

1.2 HCC组织中差异表达基因筛选 采用生物信息学分析方法。GEO筛选检索式：(hepatocellular OR liver OR hepatic OR HCC)AND (malignant OR cancer OR tumor OR neoplas OR carcinoma)。检索时间截至2018年2月。数据来源于TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)，下载并预处理HCC相关数据集的miRNA表达资料，筛选出差异表达基因，错误发现率(FDR)<0.05，差异表达倍数(FC)>1或<-1。本研究包含21份肝脏正常组织及137份HBV感染HCC组织样本。数据集中相同的miRNA表达值求和，并用log2(total_RPM+1)转变。在GEO芯片集的HCC组织中验证差异miRNA。用R语言程序包(edgeR)筛选差异表达基因。

1.3 HCC及其癌旁组织中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表达检测 采用RT-PCR法。逆转录试剂盒、引物、探针及实时定量RT-PCR试剂盒购自赛默飞公司。取总RNA各200 ng，加入RT反应体系15 μL中行逆转录反应。使用安捷伦MX3000P型荧光定量PCR仪行实时荧光定量PCR检测。反应总体系20 μL，其中2×taqman Master Mix 10 μL、cDNA 1.33 μL、taqman引物及探针1 μL、高压灭菌去离子水7.67 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。每个反应设3个复孔，计算平均值。采用2-ΔΔCt法分析目的miRNA在不同样本中的表达，U6为内参照[21～23]。U6引物序列为5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，hsa-miR-191-5p引物序列为5′-TGGTTGTTGTTTAAAATAGGAA-3′，hsa-miR-221-5p引物序列为5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′。

2 结果

2.1 HCC组织中差异表达基因筛选结果 在GSE12717筛选出43个差异表达miRNA(P<0.05，|Fold change|≥1)，GSE10694筛选出50个差异表达miRNA(P<0.05，|Fold change|≥0.5)，在TCGA中筛选出101个差异表达miRNA(P<0.05，|Fold change|≥1)。hsa-miR-221-5p、hsa-miR-191-5p在两个GEO数据集中呈现差异表达，但在TCGA中未检测出二者表达差异。

2.2 HCC及其癌旁正常组织中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表达比较 HCC及其癌旁正常组织中hsa-miR-191-5p相对表达量分别为6.03±1.82、0.93±0.08，hsa-miR-221-5p相对表达量分别为6.03±1.82、0.93±0.08。HCC组织中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表达均高于癌旁正常组织(P均<0.05)。

2.3 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表达与HCC患者临床病理特征的关系 hsa-miR-191-5p与HCC的TNM分期、转移复发有关(P均<0.05)，hsa-miR-221-5p表达与HCC的TNM分期、转移复发、包膜浸润有关(P均<0.05)；二者表达与患者其他临床病理特征无关(P均>0.05)。见表1。

表1 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表达与HCC患者临床病理特征的关系

3 讨论

miRNA作为内源性非编码单链小分子RNA，体积微小，有利于在FFPE组织中稳定保存。miRNA在FFPE与新鲜组织中表达与质量高度一致[6]。miRNA参与一系列肿瘤发生发展的生物过程，许多miRNA在肿瘤组织、血液和肿瘤细胞中表达异常，在癌症的发生发展和预后中起重要作用[6,7]。目前，生物信息学预测介入了肿瘤研究的各个方面，包括GEO、TCGA数据库在内的大数据分析，可筛选并验证在肿瘤检测和靶向治疗方面发挥作用的生物标记物。Ura等[8]发现，hsa-miR-191在HCC组织中表达上调，与He等[9]研究结果一致。以上研究均使用液氮保存的新鲜组织作为研究对象。

本研究用FFPE提取miRNA，发现hsa-miR-191在HCC组织中表达明显高于非癌肝组织，提示hsa-miR-191可能为HCC的促癌基因。He等[9]发现，hsa-miR-191在HCC组织中的高表达与患者的不良预后相关，但hsa-miR-191与患者临床病理特征的关系未见报道。本研究发现，hsa-miR-191在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期HCC组织中的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期。可见HCC临床分期越晚，hsa-miR-191的表达越高。提示hsa-miR-191与HCC的进展有关。同时，转移复发的HCC组织中hsa-miR-191的表达明显高于无转移复发者。可见hsa-miR-191高表达的HCC患者易发生转移，预后差。提示hsa-miR-191可能参与了HCC的浸润转移。Elyakim等[10]在体外实验发现，敲除hsa-miR-191后，HCC细胞增殖降低，细胞凋亡增加；在体内实验也发现肿瘤生长减慢。进一步证实hsa-miR-191可促进HCC细胞生长，抑制其凋亡。有关hsa-miR-191靶基因的报道较少，研究证实hsa-miR-191直接抑制与肿瘤转移密切相关的基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达[9]。利用双荧光素酶报告实验证实在非小细胞肺癌组织中核因子IA也是hsa-miR-191的靶标[11]。在亚砷酸盐转化的肝上皮细胞中，缺氧诱导因子2α通过调控miR-191启动子的转录激活，参与上皮间质转化，获得干细胞表型[12]。

hsa-miR-221在HCC组织中呈高表达。多项研究针对新鲜HCC组织使用芯片、Northern blottimg及RT-PCR等方法检测hsa-miR-221表达，Fu等[15]则使用原位杂交技术检测FFPE组织中hsa-miR-221表达;Karakatsanis等[19]也用RT-PCR检测了HCC的FFPE组织中hsa-miR-221表达。本研究发现HCC组织中hsa-miR-221高表达，提示hsa-miR-221在HCC的发生发展中发挥重要作用，也扮演着癌基因的角色。有研究发现，hsa-miR-221表达与HCC分期及预后相关[13,19]。本研究发现，hsa-miR-221在Ⅲ～Ⅳ期HCC组织中的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期，与研究[13,19]结果一致。同时，转移复发的HCC组织中hsa-miR-221的表达高于无转移复发者；且hsa-miR-221表达还与肿瘤包膜状态密切相关。提示hsa-miR-221表达与肿瘤细胞局部浸润和转移有关。陈罡等[20]将hsa-miR-221模拟物转染至HCC细胞系HepG2中，发现hsa-miR-221可促进HCC细胞生长，使HepG2细胞处于DNA合成的S期，进一步验证了hsa-miR-221促HCC细胞增殖的特性。同时，hsa-miR-221可抑制肝癌细胞HepG2的凋亡[20]。本研究结果认为，hsa-miR-221在HCC的进展及恶化中发挥重要作用。已证实的hsa-miR-221靶基因有Bmf[13]、DDIT4[14]、CDKN1B/p27/Kip1、CDKN1C/p57/Kip2[17]、PTEN、TIMP3、PPP2R2A[18]等，以上基因有助于解释hsa-miR-221促进HCC细胞增殖、抑制细胞凋亡及促进细胞浸润转移的分子机制。

综上所述，hsa-miR-191、hsa-miR-221在HCC组织中具有致癌作用。基于生物信息学分析结合RT-PCR检测的HCC组织中hsa-miR-191、hsa-miR-221呈高表达，二者可能参与HCC的恶性进展。hsa-miR-191、hsa-miR-221有望成为HCC的分子标志物。本研究也存在不足之处，无论是TCGA还是GEO数据库提供的都是欧美人群的数据，缺少亚洲人群的相关数据;且本研究样本较少，代表性差，后期需进行多中心研究。