结直肠癌患者血浆微小RNA-200a的表达水平及临床意义▲

潘志刚 苏东星 梁梓宇 黄晓玲 郑 捷

(广西南宁市第二人民医院消化内科，南宁市 530031，电子邮箱：panzhigang00@126.com)

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，随着我国人民生活水平的提高和饮食习惯的改变，该病的发病率呈逐年上升的趋势[1]。目前临床上常用的结直肠癌血液诊断指标为癌胚抗原和糖类抗原199，但这两个指标的假阳性率均较高[2]。研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中多个微小RNA(microRNA，miRNA)的表达水平发生显著改变，有可能作为诊断肿瘤的有效指标[3]。miRNA-200a是miRNA-200家族重要成员之一，在一些肿瘤中呈高表达[4]。研究显示，miRNA-200a在结直肠癌组织和癌旁组织的表达水平均高于正常组织，提示miRNA-200a与结直肠癌的发生密切相关[5]。然而，目前国内关于血浆miRNA-200a表达水平与结直肠癌之间的关系的研究仍较少。因此，本研究检测结直肠癌患者血浆miRNA-200a表达水平，探讨其对结直肠癌的诊断价值，并分析其与结直肠癌临床病理参数的关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年6月在我院诊治的52例结直肠癌患者作为研究对象。纳入标准：所有患者均经肠镜活检确诊为结直肠癌，临床资料完整。排除标准：合并有严重心、肝、肾疾病的患者；合并有风湿性关节炎等免疫性疾病患者。另选取同期52例健康的体检者为健康对照组，均经结肠镜检查排除结直肠部位病变，其他实验室检查结果排除其他部位肿瘤或疾病。

1.2 血液指标的检测 两组研究对象(结直肠癌组在治疗前)采集清晨空腹静脉血3 mL，常温下3 000 r/min离心10 min，取上层血浆-80℃低温冰箱中保存待测。采用i2000全自动微粒子化学发光免疫分析仪(美国雅培公司)检测血浆miRNA-200a、癌胚抗原和糖类抗原199等水平。

1.3 miRNA-200a的检测方法 采用实时荧光定量PCR法检测血浆中miRNA-200a水平。PCR仪为美国ABI公司StepOneTMReal-Time PCR仪；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司； PCR试剂盒及U6购自日本TaKaRa公司；Fast SYBR Green Master Mix及PCR相关耗材购自美国ABI公司。采用TRIzol试剂提取总RNA；所有溶液加二乙基焦磷酰胺至浓度为0.1 mol/L，振荡混匀，37℃过夜，然后高压(103.4 kPa、20 min)灭菌分解焦碳酸二乙酯。U6引物：5′CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-200a引物：5′CCTACGCCACAATTAACAAGCC-3′、5′GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3′。反应体系包括5 μg总RNA，4 μl逆转录混合反应液和1 μl反转录酶混合液。反转录反应严格按照试剂盒(日本TaKaPa公司)说明书操作。PCR反应条件为：95℃ 变性10 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共40个循环。用美国ABI公司自带的StepOne PCR系统分析软件分析，采用U6作为内参，按2-ΔΔCT法对目的基因进行相对定量检测。

1.4 研究方法 (1)收集临床资料，包括吸烟和饮酒史、年龄、性别，以及结直肠癌患者的肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移情况等。(2)分析结直肠癌患者血浆miRNA-200a水平与癌胚抗原和糖类抗原199水平的相关性。(3)分析血浆miRNA-200a对结直肠癌的诊断价值。(4)分析血浆miRNA-200a水平与结直肠癌肿瘤原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、肿瘤临床分期等临床病理参数的关系。

1.5 统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用(x±s)表示，比较采用t检验或t′检验；计数资料采用例数或百分比表示，比较采用χ2检验；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线进行诊断效能检验；血浆miRNA-200a水平与癌胚抗原、糖类抗原199水平的相关性采用Pearson检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象临床资料及血液指标的比较 两组年龄、性别、吸烟史、饮酒史等临床资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。而结直肠癌组外周血miRNA-200a相对表达水平、癌胚抗原和糖类抗原199水平均高于健康对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组研究对象临床资料及血液指标的比较

2.2 结直肠癌患者血浆miRNA-200a与癌胚抗原、糖类抗原199水平的相关性 Pearson相关分析显示，结直肠癌患者血浆miRNA-200a水平与癌胚抗原水平(r=0.128，P=0.728)、糖类抗原199水平(r=0.446，P=0.365)均无相关性。

2.3 血浆miRNA-200a诊断结直肠癌的价值 ROC曲线分析结果显示，血浆miRNA-200a水平单独诊断结直肠癌的曲线下面积为0.791(P<0.001，95%CI:0.564～0.877)，敏感度和特异度分别为81.7%和74.3%。miRNA-200a联合癌胚抗原或(和)糖类抗原199的诊断价值比单独miRNA-200a诊断价值高。见表2、图2。

表2 miRNA-200a单独以及联合癌胚抗原或(和) 糖类抗原199诊断结直肠癌的价值

图2 血浆miRNA-200a单独以及联合癌胚抗原或(和) 糖类抗原199诊断结直肠癌的价值

2.4 结直肠癌患者血浆miRNA-200a水平与临床病理参数的关系 不同性别、年龄、T分期、N分期结直肠癌患者的血浆miRNA-200a相对表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)，而在M1期和Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者的血浆miRNA-200a相对表达水平分别高于M0期和Ⅰ+Ⅱ期患者(均P<0.05)。见表3。

表3 结直肠癌患者血浆miRNA-200a 相对表达水平与临床病理参数的关系(x±s)

3 讨 论

miRNA是真核生物中一类具有调控功能的内源性非编码RNA，其长度为20～25个核苷酸。研究表明，多个miRNA在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的调控作用，可作为肿瘤诊断、治疗和判断预后的重要指标[6]。除了在肿瘤组织稳定表达之外，miRNA也能够稳定存在于血液、尿液，且经过反复冻融仍能保持相对稳定的水平[7]。已有研究表明，结直肠癌患者血清或血浆中的miRNA水平会发生显著改变，可作为诊断结直肠癌的重要生物学指标，例如miRNA-148a、miRNA-601、miRNA-760等[8-9]。因此，基于外周血的易获得性和无创性，探索外周血中的miRNA水平对结肠癌诊断和预后评估的价值成为了当下的研究热点。人类miRNA-200a定位于1号染色体36区，主要参与蛋白磷酸化、DNA结合、RNA代谢调控、小泡碎片等生物学过程[10]。miRNA-200a在结肠癌组织中的表达水平高于正常结肠组织，是影响患者预后的独立预测因子[11]。研究表明，miRNA-200a在6种结直肠癌细胞株中表达存在差异，其中在具有高转移潜能的Lovo细胞中的表达最低，在成瘤但不转移的细胞系HCT116中的表达最高；过表达miRNA-200a后，Lovo细胞的增殖和迁移能力明显减弱、细胞同质黏附能力增强且凋亡增加[12]。这提示miRNA-200a水平有可能成为结直肠癌有效的肿瘤标记物。本研究检测了结直肠癌患者与健康对照者血浆miRNA-200a表达水平，结果显示结直肠癌患者血浆miRNA-200a表达水平较健康人群升高(P<0.05)，表明结直肠癌患者血浆中miRNA-200a水平升高，其可能与结直肠癌的发生有关。但本研究结果显示，结直肠癌患者外周血血浆中的miRNA-200a水平与癌胚抗原、糖类抗原199水平均无相关性，其原因可能为本研究纳入的样本例数较少所致。

本研究还分析了血浆中miRNA-200a水平对结直肠癌的诊断价值，结果表明miRNA-200a对结直肠癌有较高的诊断效能。癌胚抗原、糖类抗原199水平是临床上辅助诊断结直肠癌的重要标记物，为了进一步提高结直肠癌的诊断准确率，本研究分析miRNA-200a与癌胚抗原、糖类抗原199水平联合诊断结直肠癌的效能，结果显示miRNA-200a联合癌胚抗原或(和)糖类抗原199的诊断效果优于单一的miRNA-200a。本研究还分析了miRNA-200a与结直肠癌患者临床病理特征的关系，结果显示外周血miRNA-200a水平可能与肿瘤的远处转移和肿瘤分期有关，即发生远处转移和晚期的结直肠癌患者血浆中miRNA-200a水平更高，这与Zuberi等[13]的研究相似，表明外周血miRNA-200a水平升高与患者预后有一定的关系。

综上所述，外周血miRNA-200a表达水平升高与结直肠癌的发生和发展可能存在密切相关，或可作为辅助诊断结直肠癌的标记物，联合检测外周血miRNA-200a以及传统肿瘤标志物癌胚抗原、糖类抗原199水平可有效地提高结直肠癌的诊断准确率。然而本研究纳入样本例数较少，因此仍需要大样本、多中心、长期随访的研究以进一步证实所得结论。