shRNA沉默ANXA1基因对FPR1及F-actin表达的影响

李 元，刘 瑞，楚元奎，杨 华

膜联蛋白A1(ANXA1)属于钙和磷脂结合蛋白超家族成员，其主要的生物学作用是以钙依赖的方式结合或黏附到脂质膜上[1]，参与炎症反应、细胞黏附与迁移、分化及增殖、细胞死亡信号调节、凋亡细胞的吞噬清除等过程。近年来，越来越多的研究表明ANXA1的表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关[2-3]，但对于ANXA1在肿瘤发生发展中的作用机制还有待阐明。因此，本研究通过构建ANXA1 shRNA慢病毒质粒，将其稳定转染脑胶质瘤U87细胞系，在下调ANXA1基因表达的情况下研究其对肿瘤细胞增殖的影响；同时探讨U87细胞在ANXA1表达受到抑制后，甲酰肽受体1(FPR1)的表达情况以及其对脑胶质瘤细胞迁移能力的影响，初步明确ANXA1/FPR1途径在脑胶质瘤发生发展过程中的作用，为开发新的肿瘤治疗靶点和治疗途径提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：293T细胞及U87细胞(本实验室保存)；感受态细胞Stbl3(上海诺百生物科技有限公司)；pDS019-pl/shRNA/GFP质粒(上海诺百生物科技有限公司)；引物Oligo(Invitrogen合成)；T4 DNA ligase(1 U/μl)(EP0061，Fermentas)；质粒提取试剂盒(AP-MN-P-250，Ayxgen)；包装质粒Packaging Mix(K4975-00)和转染试剂LipofactamineTM2000 (Invitrogen)；荧光染料SYBR Green I(CS7561，Invitrogen)； Anti-ANXA1 antibody (ab137745，Abcam)；Anti-FPR1 antibody (ab113531，Abcam)；Anti-F-actin antibody (ab205，Abcam)；Anti-G-actin antibody (ab194952，Abcam)；Anti-Tubulin antibody(ab15246，Abcam)；fMLP(F3506，Sigma)；BOC2(A-2200，Bachem)。

1.2 方法

1.2.1 重组慢病毒表达载体的构建：根据GenBank中ANXA1的cDNA序列，设计并合成3对干扰序列。将合成引物经退火、形成双链Oligo，与BsmbI酶切后形成的线性化pDS019-pl/shRNA/GFP质粒进行连接，连接产物经转化后，选取菌落PCR鉴定结果为阳性的克隆，进行扩大培养，提取质粒，送上海生工生物有限公司测序。

1.2.2 慢病毒包装及滴度测定： 使用Lipofectamine2000将经测序鉴定的3种ANXA1 shRNA重组质粒和辅助包装质粒共转染293T细胞，48 h 后收集上清液，超速离心获取慢病毒。荧光法测定病毒滴度：含病毒的浓缩上清液感染293T细胞，24 h后每孔换1 mL新鲜培养液，继续培养；感染后48 h，观察并找出GFP荧光细胞比例在10%左右的稀释梯度，记录下该梯度稀释液感染的各孔中荧光细胞的数目，取平均值。根据以下公式计算病毒滴度(BT=TU/mL):TU/ L=(P×n/100 V)×1 /DF(P=GFP +细胞数，n=105，V=病毒稀释液体积=50 μl，DF=稀释倍数。测定后重悬于DMEM培养液中，分装、贮存于-80 ℃备用。

1.2.3 慢病毒侵染效率验证及干扰RNA筛选：感染复数(MOI)值测定法验证慢病毒侵染效率。将对数生长期的U87细胞接种于96孔板，待其生长至60%～70%融合密度时，根据MOI值，加入对应量的慢病毒上清液进行侵染。分别于侵染24 h和48 h时，荧光显微镜下观察细胞生长情况和荧光比率，拍照并确定最佳MOI值。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法筛选病毒最佳干扰效率：根据目的基因序列，设计并合成qRT-PCR引物ANXA1 Primer(+)：CCACAACTTCGC AGAGTG；ANXA1 Primer(-)：CAGAACGGGAAACCATAA。根据MOI测定结果，收集细胞提取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR检测，分析干扰效果，并确定最优干扰慢病毒。

1.2.4 稳转细胞系的筛选及鉴定：取对数生长期的U87细胞接种于96孔板，培养过夜后感染病毒。以合适的MOI的病毒液侵染靶细胞，培养4～6 h 后更换新鲜的完全培养基，继续培养24～72 h，根据细胞状态进行BSD筛选，筛选10 d，建立稳转细胞系。

qRT-PCR及蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)检测U87细胞中ANXA1表达：收集筛选成功的各组稳转细胞，Trizol提取总RNA反转录成cDNA，qRT-PCR检测ANXA1基因的表达，方法同1.2.3。提取各实验组细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜4 h后，加入针对ANXA1(1∶1 000)与Tublin(1∶500)的抗体，4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜后加入相应二抗(1∶3 000)室温孵育1 h。化学发光法检测各组细胞中ANXA1蛋白表达情况。

1.2.5 MTT实验：将转染后不同实验组处于对数生长期的U87细胞胰酶消化后，稀释成1.5×104个/mL，以每孔200 μl接种于96孔板中，分别于接种后24、48和72 h，使用MTT法对细胞生长情况进行测定，根据各组吸光值绘制生长曲线图。

1.2.6 Western Blot检测FPR1及肌动蛋白(G-actin与F-actin)表达情况：常规培养U87细胞、control shRNA U87细胞、FPR1-shRNA U87细胞及ANXA1-shRNA U87细胞，在ANXA1-shRNA U87细胞中分别加入FPR1抑制剂BOC2及其激活剂fMLP，作用24 h后收集不同处理组细胞，提取总蛋白，蛋白定量后行SDS-PAGE电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭后，分别加入适量的针对FPR1(1∶500)、F-actin(1∶250)、G-actin(1∶1 000)与Tublin(1∶500)的抗体，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后加入相应二抗(1∶3 000)室温孵育1 h。TBST洗膜后化学发光法检测各组细胞中FPR1、F-actin及G-actin蛋白表达变化。用Image J软件对Western Blot 图像进行灰度扫描。

2 结果

2.1 阳性克隆的PCR鉴定：经测序验证，结果显示(见图1，目录后)3个插入序列与shRNA序列完全一致，证实ANXA1表达载体构建成功。

2.2 慢病毒包装及滴度测定：荧光显微镜下293T细胞中有大量GFP荧光表达，显示病毒包装成功。经计算，3个重组质粒慢病毒滴度分别为RNAi1：1.3×109TU/mL；RNAi2：1.3×109TU/mL；RNAi3：9.0×108TU/mL。

2.3 慢病毒侵染效率验证及干扰筛选：在MOI=30～60时，细胞阳性比例(荧光率)较高、细胞状态较好。将干扰慢病毒以MOI值30侵染靶细胞。侵染48 h 后收集细胞提取总RNA，以qRT-PCR验证干扰效率。慢病毒对ANXA1基因干扰效率分别是95.570%、71.743%、68.720%。

2.4 稳转细胞系的建立与鉴定：用4 μg/mL BSD作为筛选浓度，建立ANXA1 shRNA 的脑胶质瘤U87细胞稳定转染细胞系，荧光显微镜下可见荧光强度达90%以上(见图2，目录后)。

提取细胞总RNA及总蛋白，行qRT-PCR及Western Blot检测，结果显示：干扰稳转细胞系中，ANXA1基因及蛋白表达水平显著低于对照组(见图3，目录后)，证明稳转细胞系构建成功。

2.5 ANXA1蛋白下调对U87细胞增殖的影响：将ANXA1-shRNA 稳转U87细胞分别培养24、48和72 h后，MTT法检测各组细胞的生长情况，结果发现与control shRNA组及U87对照组相比，ANXA1-shRNA干扰组在培养72 h 后细胞增殖能力明显下降，细胞生长明显被抑制(P<0.05)；与control shRNA组相比，ANXA1-shRNA干扰组的细胞生长24、48和72 h 的抑制率分别为81.5%、83.2%和85.0%，而两对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 ANXA1对FPR1表达的影响：为了检测ANXA1对FPR1的影响，在ANXA1 shRNA细胞中分别加入FPR1抑制剂BOC2及其激活剂fMLP，结果显示，与对照组相比，干扰ANXA1表达后，FPR1蛋白表达水平明显降低，ANXA1与FPR1抑制剂协同作用时，FPR1蛋白表达水平显著降低。干扰ANXA1表达后再加入FPR1外源激活剂fMLP时，FPR1蛋白表达增加，见图3(目录后)。

2.7 ANXA1通过FPR1对U87细胞中F-actin/G-actin比值的影响：为了进一步研究FPR1在ANXA1促肿瘤细胞迁移侵袭中的作用，在ANXA1-shRNA细胞中分别加入FPR1抑制剂BOC2及其激活剂fMLP后，提取不同处理组的细胞总蛋白，用特异性肌动蛋白抗体(G-actin与F-actin)检测肌动蛋白的相对含量，分析F-actin与G-actin的比值。结果显示：与对照组相比，分别干扰FPR1、ANXA1及同时干扰ANXA1与FPR1，F-actin/G-actin的比值分别下调。加入FPR1外源激活剂fMLP后，F-actin/G-actin的比值增加，见图4(目录后)。

3 讨论

膜联蛋白A1(ANXA1)是一个37 kDa 的钙依赖的磷脂结合蛋白，在细胞中含量较高(占细胞蛋白质含量的0.5%～2%)，主要参与膜转运及信号传导、调控炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动[4]。ANXA1可以与细胞骨架上的F-actin和G-actin结合并相互作用，调节肌动蛋白的聚合作用，并与G-actin的结合蛋白相互作用，参与膜相关细胞骨架的调节，通过这种翻译后的修饰过程参与细胞内多种生物学活动的调节。

越来越多的研究表明，膜联蛋白A1的表达异常与多种肿瘤的发生发展有关，ANXA1表达水平在不同类型的肿瘤中有差异，在同一肿瘤的不同类型中也有显著变化，可能与肿瘤的侵袭迁移相关[5]。在乳腺肿瘤中，通过检测大鼠腺癌细胞中ANXA1表达与乳腺癌转移的关联性发现，ANXA1表达程度可能与肿瘤的转移潜能呈正相关[6]。Kim等在黑色素细胞瘤的高转移潜能B16/BL6和低转移潜能B16/F10细胞系中，通过siRNA证实了ANXA1参与该肿瘤的侵袭转移，推测ANXA1通过激活甲酰肽受体(FPR)家族来调节肿瘤的侵袭转移能力[7]。FPR1作为G蛋白耦联受体家族成员之一，能够被细菌源性多肽如N-甲酞-甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酰胺(fMLP)和一些宿主源性的多肽如来源于肿瘤细胞的ANXA1等激活，进而介导恶性肿瘤细胞的迁移与侵袭。在结肠腺癌细胞中，应用siRNA干扰ANXA1的表达，发现ANXA1可以调节结肠腺癌的迁移侵袭，而该功能是通过功能性N-甲酰肽受体(nFPRs)活化介导的[8]，nFPRs可以诱导极化F-actin聚集[9-10]，后者可以促进肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[11]。F-actin参与肿瘤细胞的黏附、迁移及运动，使肿瘤细胞与周围基质的黏附力下降并增强肿瘤细胞的迁移、运动能力，促进肿瘤细胞向周围侵袭性生长[12]，因此F-actin是衡量肿瘤细胞恶性程度的一个指标。

本实验前期采用免疫组织化学法，分析了20例胃炎与80例胃癌标本中ANXA1的表达情况，显示ANXA1在胃癌组织中高表达。通过研究ANXA1表达与胃癌临床病理特征之间的关系，发现ANXA1在胃癌组织中的高表达与肿瘤的淋巴结转移高度相关，而与患者年龄、性别、胃壁侵犯、分期、分化等无显著相关性，提示ANXA1可能在胃癌的发生发展及早期血行、局域引流淋巴结转移中起到促进肿瘤细胞转移的作用[13]。

为了进一步研究ANXA1在肿瘤发生发展中的作用，及其可能通过nFPRs诱导F-actin重构进而促进肿瘤细胞的侵袭与迁移，本实验以ANXA1基因为靶基因，使用RNA干扰技术，设计了3对特异性shRNA序列，构建了3个干扰慢病毒载体，qRT-PCR检测结果表明重组质粒均可显著抑制ANXA1的表达，尤以RNAi1重组质粒的干扰效率最佳。将其导入U87细胞后，经qRT-PCR及Western Blot验证，显著抑制ANXA1的表达。随后进行的细胞增殖实验结果表明ANXA1下调对U87细胞的增殖有明显的抑制作用，说明ANXA1在肿瘤的发生发展中发挥了一定的作用。同时，我们也检测了ANXA1对FPR1表达的影响。在ANXA1-shRNA细胞中分别加入FPR1抑制剂BOC2及其激活剂fMLP，结果显示ANXA1可以影响FPR1的表达，ANXA1可能通过激活FPR来介导肿瘤细胞的迁移与侵袭，但其对肿瘤细胞迁移、侵袭影响的机制尚不十分清楚。肌动蛋白是构成细胞骨架微丝的基本成分，以球状单体肌动蛋白(G-actin)或丝状聚合体肌动蛋白(F-actin)形式存在，G-actin经聚合成为F-actin。F-actin含量增加提示细胞内肌动蛋白发生聚合，反之则提示细胞内F-actin发生解聚。一些研究表明nFPRs可以诱导F-actin聚集进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[9-10]。因此，我们检测了细胞中F-actin、G-actin的表达，结果发现单独或同时干扰ANXA1及FPR1均可下调F-actin/G-actin比值；而在ANXA1干扰细胞中加入FPR1外源激活剂fMLP后，F-actin/G-actin的比值增加，抑制FPR1表达可下调ANXA1对F-actin、G-actin表达的影响，表明ANXA1可能通过FPR1影响肌动蛋白的重构，进一步改变肿瘤细胞迁移侵袭特性。