石斛多糖对SHR晚期糖基化终产物代谢变化及其与炎症冈子的关系

2020-03-02 02:16陆积新李近都潘兴寿李天资邹才华曾德创梁烨
中国医药科学 2020年1期
关键词:炎症因子

陆积新 李近都 潘兴寿 李天资 邹才华 曾德创 梁烨

[摘要]目的 探讨石斛多糖对自发性高血压大鼠(SHR)炎症因子和晚期糖基化终产物代谢的效果及其剂量。方法 提取石斛多糖,将SHR随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组四组,对照组给开水,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给石斛多糖100、300、500mg/d,干预2个月,比较干预后各组肿瘤坏死因子(TNF-α),白细胞介素(IL)-6,IL-10,晚期糖基化终产物(AGE),可溶性AGE受体(sRAGE)和全长AGE受体(RAGE)mRNA水平。结果 与对照组比较,低剂量组TNF-α水平比较,差异有统计意义(P<0.05),中剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计意义(P<0.05),高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计意义(P<0.05)。低剂量组sRAGE水平差异有统计意义(p<0.05),中剂量组sRA(-.E和RACE mRNA水平比较,差异有统计意义(P<0.05),高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平比较,差异有统计意义cP<0.05)。石斛多糖能够有效缓解SHR的炎症因子和晚期糖基化终产物代谢紊乱。其改善TNF-α、IL-6、IL-10、AGE、sRAGE和RAGE mRNA的作用有剂量效应关系,纠正SHR炎症因子功能紊乱的有效剂量为300mg/d;纠正SHR晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱的有效剂量为500mg/d。结论 石斛多糖可有效缓解SHR的炎症因子功能紊乱,降低AGE水平,提高sRAGE水平,降低RAGE基因的活化,对缓解SHR的血管重塑有积极的作用。其药效有剂量效应关系,中等剂量可有效改善炎症症状,高剂量能改善AGE及其受体症状。

[关键词]石斛多糖;炎症因子;晚期糖基化终产物;晚期糖基化终产物受体

[中图分类号]R285.5

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616(2020)01-09-05

晚期糖基化终末产物(advanced glycationendproducts,AGE)能够和身体的组织细胞相组合,导致慢性退化型疾病的发生,是全球医学界最为热门的领域之一,AGE受体(receptor for advancedglycation end-product,RAGE)是细胞表面分子的免疫球蛋白超家族成员之一,与AGE及蛋白质分子相互作用参与炎症反应,高水平的AGE可促进RAGE的表达,诱导细胞信号转导与促进AS的发生和发展有关[1]。可溶性RAGE(soluble receptor foradvanced glycationend products, sRAGE) 与RAGE结构相似,可竞争性地与AGE结合,对保护血管细胞,改善AS进程有积极的作用,成为临床药学关注的热点[2]。石斛(dendrobium)含有丰富的酚类、类萜类和含氮类等重要药用成分,具有滋阴清热,抑制炎症反应,增强免疫力等功效,在AS中发挥了积极的作用,但其作用的靶点及其机制还不完全清楚[3]。为探讨石斛对AS的疗效及其机制,本研究观察石斛多糖干预SHR后其肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-10、AGE、sRAGE和腹主动脉平滑肌RAGE mRNA表达水平的变异情况。

1 材料与方法

1.1铁皮石斛多糖

采用人工栽培铁皮石斛(广西根辽生物技术有限公司提供),经本校何思陆主任药师鉴定为铁皮石斛(Dendrobium candidum)。铁皮石斛多糖提取按文献[4]:取新鲜品铁皮石斛茎1000g,100℃杀青30min,60℃烘箱烘干24h,100目粉碎机粉碎,80℃热水浸提2h,离心、抽滤、浓缩至原有体积的1/6,醇沉24h,离心,真空干燥。热水回流加纤维素酶(Cellulase)纯化,水浴加热浓缩至含生药量为1g/100mL的药液,杀菌,贮存于4℃冰箱内备用。

1.2动物喂养与药饲

(1)自发性高血压大鼠(SHR)和饲料:SHR由中山大学北校园实验动物巾心提供,动物合格证号:SYXK(粤)2017-0081。选购2个月±2d龄雄性SHR大鼠48只,普通级。鼠饲料丸由上海新奇特种饲料厂提供。(2)喂养方法:鼠饲料丸架式笼养,室温(20±2)℃,相对湿度(75±5)%,光照明暗各12h交替,喂养至8个月±2d月龄,平均体重为(352+5)g时给予药物干预。(3)分组药饲:将48只SHR大鼠随机分为对照组、低剂量组、巾剂量组和高剂量组四组,每组12只共一笼饲养。(4)药物剂量:根据2010年版《中国药典》成人70kg推荐剂量10g/d,SHR体重0.35kg,按照人用量推算动物给药量,SHR等效剂量约为人的6.3倍,本研究用石斛剂量为:低剂量组100mg/d,中剂量组300mg/d,高剂量组500mg/d。(5)给药方法:低剂量组口腔给石斛多糖药饮100mg/d(取10.0mL药液加水40mL);巾剂量组口腔给石斛多糖藥饮300mg/d(取30.0mL药液加水10mL);高剂量组口腔给石斛多糖药饮500mg/d(取50.0mL药液),每天1次。对照组口腔给开水50.0mL/d。四组均等量喂鼠饲料丸,饮用水自由饮用,连续2个月。

1.3标本采集

于干预后麻醉SHR进行标本采集。(1)麻醉方法:碘伏消毒,以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。(2)血液标本采集:剃去腹部的毛,解剖,切腹壁打开腹腔,从腹腔静脉取血0.5mL,低温分离取血清。(3)标本采集:剪取腹主动脉平滑肌15mm×3mm组织,剪成5mm×3mm共3小块,分别置于3个冻存管,于30min内液氮固定4h,移至-70℃冰箱保存备检。

1.4标本检测

TNF-α、IL-6、IL-10和sRAGE测定用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,试剂盒由杭州沃森生物技术有限公司提供,用美国BIO RAD 550型酶标仪检测,严格按检测方法和程序进行。

1.5RAGE mRNA表达检测

用RT-PCR法,取100μL腹肌匀浆,用Trizol试剂提取总RNA,氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度,取10μL,逆转录合成cDNA,-70℃冻存备用。取5μL逆转录产物进行PCR扩增反应,并以β-actin为内参对照。根据Gene Bank人类RAGE基因(Gene Bank登录号AB036432)设计RAGE基因引物,由杭州联川生物技术有限公司设计合成。RAGE基因序列为F:5'一GGGGTACCAAGGAAGCAGGTAGGCAGCC-3';R:5'-CCGCTCGAATCCATTCCTGTTCATCTGC-3',扩增长度328bp。管家基因序列为F:5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3';R:5'一AAACGCAGCTCAGTAACAG-3',扩增长度225bp。PCR反应条件:55℃逆转录反应60min,94℃变性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min,共30循环,72℃延伸7min。胶回收试剂盒回收目的基因片段。PCR产物在琼脂糖凝胶巾电泳,凝胶成像仪采集图像,PCR仪获得产物Ct值,采用2-△△Ct相对定量计算公式计算分析。

1.6统计学分析

应用SPSS20.0版本软件进行统计处理,计量资料以(χ±s)表示。两组资料比较采用独立样本t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,组间比较用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1石斛多糖对SHR血清TNF-α、IL-6和IL-10水平的影响

与对照组比较,低剂量组TNF-α水平差异有统计意义(P<0.01),巾剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量组比较,巾剂量组TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.01),高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与巾剂量比较,高剂量组TNF-α和IL-6水平差异有统计学意义(P<0.01)。提示石斛多糖能有效纠正炎症功能紊乱,表现为降低TNF-α和IL-10水平,提高IL-6水平,治疗SHR炎症因子的有效剂量为石斛多糖300mg/d,连用2个月。将剂量提高到500mg/d,其纠正炎症功能紊乱效果差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2石斛多糖对SHR血清AGE、sRAGE水平和动脉平滑肌组织RAGE mRNA表达的影响

与对照组比较,低剂量组sRAGE水平差异有统计学意义(P<0.01),中剂量组sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量组比较,巾剂量组sRAGE水平差异有统计学意义(P<0.01),高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义(P<0.01)。与巾剂量组比较,高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义(P<0.01)。提示石斛多糖能有效纠正晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱,表现为提高sRAGE水平,降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效纠正SHR AGE及其受体功能紊乱的有效剂量为500mg/d,连用2个月。见表2。

3 讨论

有关糖基化产物(AGE)及其特异性受体(RAGE)的结构及其对各种疾病病理机制作用的共识正在不断更新,AGE是一种对机体有害的高度活性的羰基化合物,营养物质经过美拉德(Maillard)反应产生的终末产物,AGE在非酶促条件下,营养物质中的蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子游离的氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后等美拉德反应产生的,首先大分子末端的还原性氨基与还原糖分子中的醛基发生加成反应,形成希夫碱(Schiff bases),其次希夫碱再发生阿马道里(Amadori)重排,形成早期糖基化产物醛胺类,再次醛胺类再经过脱水,重排反应生成乙二酸(草酸),3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)和甲基乙二醛(丙酮醛)等AGE[5]。体内AGE的主要来源一是食物中存在通过进食将AGE摄入体内,另外当体内葡萄糖浓度异常增高时,体内AGE的合成加速,分解减缓[6]。当AGE异常增高时,细胞表面的RAGE与AGE配体相互作用产生效应,导致许多慢性退化型疾病的发生[7]。人类RAGE编码基因位于6号染色体上,包含11个外显子和10个较短的内含子[8]。RAGE是一类模式识别受体,正常情况下RAGE表达量很低,当机体出现AGE聚集,RAGE表达量上调,激活如磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)、分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases.MAPK)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)、信号传导及转录激活因子(signal transducers and activatorsof transcription,STAT)等多种信号传导通路的级联放大反应,激活下游核转录因子(NK-K B)等,调节多种基因的转录表达,炎症因子释放,导致血管通透性增高,单核细胞粘附,基质成分增多等病理变化,在动脉粥样硬化损伤的发生发展巾发生作用[9]。研究认为,AGE与RAGE配体结合后,RAGE将信号传递至胞内,从而引发由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、细胞外信号调节激酶、p38丝裂原蛋白激酶和NF-KB等构成的信号转导途径[10]。虽然AGE与RAGE配体结合后RAGE首先与哪种蛋白结合,目前还不完全清楚,但对RAGE多聚核糖体mRNA研究发现,RAGE有3种主要的剪接变异体,分别为全长膜结合型(RAGE)、截去C端可溶型(sRAGE)和截去N端膜结合型。RAGE有完整的胞外段、膜镶嵌区和胞内段;sRAGE为RAGE的胞外段部分,缺少跨膜镶嵌区和胞内段;膜结合型仅有膜镶嵌区和胞内段,没有胞外段部分[11]。因此只有RAGE和sRAGE能与配体结合,膜结合型由于缺失胞外段不能与配体结合。而sRAGE缺少跨膜镶嵌区和胞内段,其AGE配体结合后,信号不能传递至胞内,不会发生信号传导通路的级联放大反应,同时sRAGE可与RAGE竞争结合其配体,对机体的多种病理状态起到保护作用[12]。降低AGE,阻断RAGE表达量上调,刺激机体产生更多的sRAGE等,被认为是缓解氧化应激,预防动脉粥样硬化及其并发症的方向标[13]。肿瘤坏死因子超家族和白细胞介素是重要细胞因子之一,其通過免疫原、丝裂原等刺激剂诱导产生并通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式在靶器官巾发挥作用,机体在遭受各种有害刺激时,致病因子TNF-α,IL-10产生过多,保护因子IL-6受抑,促进动脉粥样硬化损伤[14]。祖国医学认为风寒暑湿燥火等从经络传人脏腑,导致痰浊、血瘀、痰瘀交阻是糖基化产物代谢紊乱慢性血管疾病的病机,是“痰浊”辨证的客观表现,早在东汉时期,张仲景在《金匮要略》巾描述石斛具有益气健脾,理气活血,补脾益阳等功效,是温阳健脾的重要代表方剂,现代药理学认为石斛多糖有抗炎、抗病毒、调节免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究结果显示,用石斛多糖干预自发性高血压大鼠,可明显增高其IL-6和sRAGE水平,降低其TNF-α,IL-10,AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通过降低AGE生成和积累,提高sRAGE表达,抑制RAGE活化,改善SHR大鼠炎症功能紊乱状态,在SHR的血管损害病理过程中起到保护性作用。中医认为动脉粥样硬化性疾病本为阴阳失调,标为内生之风、痰浊和瘀血。治疗上应当用活血化瘀,行气通络,豁痰利气等[16-22]。本研究结果提示,石斛多糖可有效缓解SHR的炎症反应和晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱状况。石斛多糖对改善SHR的症状有剂量效应关系,改善炎症症状巾等剂量,改善晚期糖基化终产物及其受体症状的剂量比较高。石斛多糖为治疗血管重塑提供新型的空间。

[参考文献]

[1]何思陆,李天资.FXYD5在高血压病动脉粥样硬化中调控机制的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015. 13(15):1730-1732.

[2]Yamamoto KI, Murata H.Signal Diversity of Receptor forAdvanced Glycation End Products[J].Acta Med Okayama,2017. 71(6):459-465.

[3]曾德创,邹才华,李近都,等.石斛治疗血栓闭塞性脉管炎患者炎症细胞因子变化的观察[J].中国医药科学,2016,6(21):9-12,17.

[4]黄晓君,聂少平,王玉婷,等.铁皮石斛多糖提取工艺优化及其成分分析[J],食品科学,2013,34(22):21-26.

[5]Klont F,Pouwels SD, Hermans J,et al.A fully validatedliquid chromatography-mass spectrometry method forthe quantification of the soluble receptor of advancedglycation end-products(sRAGE):in serum usingimmunopurification in a 96-well plate format[J].Talanta.2018. 182(1):414-421.

[6]Kolliker Frers RA, Cosentino V, Tau J,et al.lmmune-mediated inflammation promotes subclinical atherosclerosisin recent-onset psoriatic arthritis patients withoutconventional cardiovascular risk factors[J].Front Immunol,2018,9:139.

[7]Ritarwan K, Lelo A, Pane YS, et al.lncreasingatherosclerosis in streptozotocin-induced diabetes into fourgroups of mice[J].Open Access Maced J Med Sci, 2018,6(2):287-292.

[8]刘言凤,余文珍,施红.石斛合剂对H202诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用[J].中华中医药杂志,2016,31(10):4271-4274.

[9]Mirlohi MS, Yaghooti H, Shirali S,et al.lncreased levelsof advanced glycation end products positively correlatewith iron overload and oxidative stress markers in patientswith β -thalassemia major[J].Ann Hematol, 2018, 97(4):679-684.

[10]Murakami Y, Fujino T,Hasegawa T,et aI.Receptor foradvanced glycation end products(RAGE):-mediatedcytotoxicity of 3-hydroxypyridinium derivatives[J].BiosciBiotechnol Biochem, 2018, 82(2):312-319.

[11]梁燁,邹才华,李近都,等.石斛药用次生代谢产物及其基因克隆研究进展[J].中华中医药杂志,2018,33(12):5511-5514.

[12]Gasparotto J,Girardi CS, Somensi N,et aI.Receptorfor advanced glycation end products mediates sepsis-triggered amyloid-p accumulation, Tau phosphorylation,and cognitive impairment[J].J Biol Chem, 2018, 293(1):226-244.

[13]李俊峰,刘文洪,张贝贝,等.铁皮石斛内生菌的分离及代谢产物活性的初步研究[J].中华中医药杂志,2016,31(3):970-974.

[14]黄元东,潘兴寿,梁烨,等.铁皮石斛对急性有机磷农药中毒患者解毒及其抗免疫的疗效观察[J].中国地方病防治杂志,2014,29(S2): 204.

[15]曾德创,邹才华,李近都,等.血管重建术治疗血栓闭塞性脉管炎患者的疗效观察[J].右江医学,2017,45(2): 134-137.

[16]潘兴寿,梁烨,李天资,等.野芭蕉辅助治疗高血压伴稳定劳力型心绞痛PCI术后患者炎症反应疗效观察[J].时珍国医国药,2014,25(9):2171-2173.

[17]李鸿翔,梁烨,李天资,等.原发性高血压危险因素的易感基因及其非编码RNA研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(7): 879-881.

[18]陆高翔,韦华,李天资,等.解痉通络活血治疗高血压病患者炎症因子变化的临床研究[J].辽宁中医杂志,2009, 36(8):1306-1308.

[19]梁烨,李天资,陆高翔,等.野芭蕉治疗自发性高血压大鼠疗效机理的实验研究[J].时珍国医国药,2013,24(10):2324-2326.

[20]潘小炎,李天资,周喜汉,等.石斛治疗实验性大鼠萎缩性胃炎的医学研究[J].右江医学,2009,37(1):1-3.

[21]李天资,梁烨,陆高翔,等.野芭蕉治疗高血压颈动脉斑块阳性患者疗效机制的临床研究[J].时珍国医国药,2012, 23(9):2259-2260.

[22]Birgin E,Gebhardt C,Hetjens S,et al.ExtracorporalShock Wave Therapy Enhances Receptor for AdvancedGlycated End-Product-Dependent Flap Survival andAngiogenesis[J].Ann Plast Surg, 2018, 80(4):424-431.

(收稿日期:2019-04-09)

[基金项目]国家自然科学基金(81060028);广西重大专项基金(桂科重1598005-9,桂科攻1355005-3-7);广西卫生基金(GXZC1242)。

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