1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂的毒理学研究

李 卓 陈燕娟 刘士华

作者单位：张家港市华天药业有限公司 215600

1,6-二磷酸果糖三钠盐(英文名称D-Fructose 1,6-diphosphate trisodium salt)，简称FDP，别名1,6-二磷酸果糖，为一种重要的细胞内代谢产物，能直接调节很多代谢途径，尤其对于能量代谢和某些酶活性可发挥重要的调节作用[1]。临床上主要用于提高对心肌缺血造成缺氧的耐受能力和改善糖代谢[2]，具有明显的抗疲劳、耐缺氧、降低血糖等作用[3]。FDP在国内外已广泛应用于医药、保健食品等方面。目前，国内对1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)复方制剂的毒理学研究尚未报道。本试验1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)复方制剂是某企业研制的保健食品复方产品，为确保其食用安全性，根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》，对1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂进行了急性毒性试验、遗传毒性试验。

1.材料与方法

1.1 样品 1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂：由1,6-二磷酸果糖三钠盐、维生素B1、维生素B6、L-天门冬氨酸制成的保健食品，胶囊内容物为微黄色粉末，由某企业提供。人体推荐量为每日4粒，共1.6g，其中每粒含有1,6-二磷酸果糖三钠盐300mg，维生素B130mg、维生素B630mg、L-天门冬氨酸40mg。

1.2 动物 昆明种小鼠，均由南京铁道医学院实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性试验：昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重为18～22g，随机分为4个剂量组(2.15g/kg、4.46g/kg、10.00g/kg、21.5g/kg)，采用霍恩氏法，灌胃给予受试物，连续观察14天，记录动物中毒症状及死亡情况。

1.3.2 Ames试验：采用平板掺入法，用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株,试验剂量设0.2μg/皿、5μg/皿、50μg/皿、500μg/皿、1000μg/皿，同时设空白对照、阳性对照组。在活化与非活化条件下37℃培养48小时，计数每皿回变菌落数。

1.3.3 小鼠骨髓细胞微核试验：昆明种小鼠，25～30g，50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。剂量分别为1000mg/kg、2000mg/kg、4000mg/kg，、阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺组，40mg/kg)。采用间隔24小时两次灌胃给受试物，第二次灌胃后6小时处死动物，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa染色。每组观察计数1000个完好嗜多染红细胞，计算微核率。

1.3.4 小鼠精子畸形试验：选雄性小鼠25只，随机分为5组。设2500mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg体重3个剂量组、阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺组，40mg/kg)。灌胃给予受试物，连续5天，至第35天颈椎脱臼法处死小鼠，取出二侧附睾，常规制片，甲醇固定，用1%的伊红染色，于显微镜下观察形态。每鼠计数1000个结构完整的精子，纪录精子畸形数并统计精子畸形率(%)。

2.结果

2.1 急性毒性试验 14天观察期内，各剂量组雌、雄小鼠均无死亡及中毒症状。小鼠急性经口LD50大于21.5g/kg。根据急性毒性分级，该复方制剂属无毒物质。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 Ames试验：由表1可见，各浓度无论是否加入S-9混合液各皿回变菌落均未大于自然回变数的2倍，也无剂量反应关系。而各阳性对照组均显示强烈的诱变作用。结果判断，1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂无致突变作用。

表1 1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂Ames试验结果

注：*阳性对照物：TA97(-S9)：米帕林，TA98(-S9)：柔红霉素，TA100(-S9)：叠氮钠，TA102(-S9)：丝裂霉素C，TA97(+S9)、TA98(+S9)、TA100(+S9)、TA102(+S9):2-乙烯氨基芴。

2.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验：由表2可见，试验组动物在各试验剂量下，PCE微核出现率，PCE/RBC均与阴性对照组一致，而阳性对照显示强烈的致突变作用。根据该试验结果，1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂在上述剂量下未见致突变作用。

表2 1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

2.2.3 小鼠精子畸形试验：由表3可见，阴性对照组的精子畸变率为1.44%，属于小鼠正常畸变范围内，阳性对照组(环磷酰胺组)的精子畸变率为6.36%，显著高于阴性对照组(P<0.01)。3个剂量下的样品组的精子畸变率分别为1.38%、1.34%和1.52%。与阴性对照组的1.44%比较，未见显著差异(P>0.05)，而且无剂量反应关系，说明本次检测的1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂对小鼠精子无致突变作用。

表3 1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂对小鼠精子畸形率的影响

3.讨论

1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)是葡萄糖代谢过程中的重要中间产物，可以影响机体ATP的供能[5]。它在缺氧条件下，能够进入细胞内，激活细胞内磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，并作为底物,通过糖酵解途径提供能量[6]。目前1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)主要研究方向在缺氧缺血性脑病、心肌缺血所致的心律失常、改善心供能[7]、急性心力衰竭[8]、运动能力的影响[9]等。

1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)的临床应用主要是静脉注射，口服用制剂报道很少。本试验通过对复配维生素B1、维生素B6、L-天门冬氨酸制成的口服用复方制剂，进行了毒理学研究。维生素B1、维生素B6、L-天门冬氨酸作为食品添加剂都是安全的。维生素B1的辅酶形式焦磷酸硫胺素(TPP)是丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、转酮醇酶的辅酶。缺氧时自身TPP不能满足机体代谢需要，额外补充维生素B1有助于促进丙酮酸氧化脱羧，从而使三羧酸循环正常运转，促进糖的有氧氧化。维生素B6的主要辅酶活性形式是5-磷酸吡哆醛(PLP)和5-磷酸吡哆胺(PMP)。PLP通过参与转氨作用将体内的蛋白质、糖类和脂肪代谢联系起来[10]。L-天门冬氨酸可刺激缺血心肌丙酮酸转氨作用,将乳酸通过丙酮酸转变为丙氨酸,从而解除因乳酸堆积而导致糖酵解关键酶的抑制[11]。1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)是糖代谢的中间产物,它能反馈刺激糖酵解限速酶磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)的活性,而促进糖酵解,并能绕过PFK反应步骤直接进入糖代谢途径,参与ATP合成代谢[12]。维生素B1、维生素B6、L-天门冬氨酸可以协同1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)发挥在糖代谢过程中的生理功能，对开发1,6-二磷酸果糖三钠盐(FDP)口服用复方制剂有参考作用。

在本次试验中，对1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂进行了小鼠经口急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验。小鼠经口LD50>20g/kg体重，根据急性毒性(LD50)剂量分级标准，该样品为无毒级；Ames试验无论加与不加S9活化系统均为阴性结果；小鼠骨髓细胞微核试验为阴性结果，表明该样品无细胞毒性作用；小鼠精子畸形试验为阴性结果，表明该样品对生殖细胞无致突变。因此，我们认为1,6-二磷酸果糖三钠盐复方制剂为无毒级，亦无致突变作用，是安全的。