ICR 小鼠自发运动、探索行为和焦虑情绪的检测及其参考值的确立

刘洋，姚睿智，史宏昭，刘鹏，李士泽

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

ICR 小鼠多被应用于生命科学、神经科学、生理心理学和神经精神药物学等研究领域，使用广泛[1]。特别是因其独有生理特征得到了学者们的关注和认可，成已经为了情绪障碍、感觉运动和认知功能这三大类神经行为学研究中的主流试验动物[2]，地位无可取代。但神经行为学测试对试验环境、测试条件和操作程序及受试动物体况等因素有着较为严格的要求，一旦对这些敏感因素把控不严，会给试验结果造成不可估量的影响，这也严重阻碍了研究人员间的相互比较、参考。因此，研究选取了两个个可互相印证、结果一致性的旷场试验（open field test，OFT）和高架十字迷宫试验（plus maze test，PMT）来测定ICR小鼠的相关神经行为学指标，探讨ICR 小鼠的行为特征，确立其参考范围，为自发运动、探索行为和焦虑情绪的进一步研究奠定坚实的基础，为今后的运动能力和情绪障碍这两大方面神经行为学研究提供有价值的参考，为神经行为学研究中异常数值的筛选和剔除提供合理的依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心的8 周龄的ICR 小鼠200 只（雌雄各半）。小鼠在人工智能气候室中进行为期7 d 的适应性饲养，环境温度设定为28±0.5 ℃，湿度为（40±5）%，自由采食、饮水。每5 只同性别ICR 小鼠群养于聚苯乙烯标准鼠笼中[鼠笼大小为375 mm（长）×173 mm（宽）×165 mm（高）]。每笼给予200 g 的松软木屑垫料，每周更换垫料2 次。日光灯照明，光照强度为200 Lux，明暗周期比为12 L∶12 D（开灯8:00 am，关灯8:00 pm）。

适应性饲养完成后，观察ICR 小鼠的健康状况并筛选和剔除提出异常、发情小鼠，将在最终获得ICR 小鼠分别用于旷场试验、高架十字迷宫试验（各神经行为学测试装置说明、操作方法、记录指标将在下面详细介绍，n=90，雌雄各半）。

1.1 实验仪器与装置

试验中所用的TM-Vision 行为学试验视频分析系统、OFT-100 旷场试验箱、PMT-100 高架十字迷宫和落地式试验站等主要仪器均购自于成都泰盟软件有限公司。

落地式试验站相对独立于外界环境，可减少行为学实验因环境、灯光、气流、噪音、人为干扰等的影响，因此所有的行为学测试全程均在落地式试验站中进行。其顶部两侧装有2 盏40 W 的日光灯作为照明系统，以保持观察箱内的光照条件一致；箱顶正中固定一个与TM-Vision 行为学试验视频分析系统连接的高清摄像头，用以收集并记录图像、试验进程。

1.2.1 旷场试验装置

旷场试验箱外形尺寸为625 mm（L）× 740 mm（W）× 510 mm（H），正面外侧配有反光镜，底壁及四周侧壁由黑色塑胶构成（图1 A）。

图1 旷场试验装置Fig.1 Open-field test device

1.2.2 高架十字迷宫装置

高架十字迷宫是由2 个开臂 [300 mm（长）×60 mm（宽）× 6 mm（高）]，2 个闭合臂[300 mm（长）×60 mm（宽）× 150 mm（高）]和1 个中心区域[60 mm（长）× 60 mm（宽）]组成，迷宫高度为500 mm，迷宫和闭臂侧壁均是由黑色塑胶构成（图2 A）。

1.3 测定程序

适应性饲养期间，实验员每天抓摸小鼠10 min，使其适应试验人员的捕捉操作，避免试验时产生应激。实验开始前30 min 将小鼠移入测试室适应，以减少新异环境刺激对小鼠活动的影响，保证试验时小鼠活动趋于稳定。各组均在上午（8:00～11:00）依次完成相应的神经行为学测试。每只小鼠仅测试1 次，不再重复测定。试验过程中严格控制环境因素，确保一致；保持测试室内安静，试验人员不可更换，不可使用香水或其他有刺激性气味的物品。每次测试结束，清理粪便，彻底清洗试验装置底部和侧壁，喷洒75%酒精，同时打开通气，直至试验装置及落地试验站内干燥无异味后再进行下一只小鼠的测试，避免前次受试小鼠的残留气味影响下一次的试验。

图2 高架十字迷宫装置Fig.2 Plus maze test device

1.3.1 旷场试验测试

打开OFT-100 旷场试验视频分析系统，设置试验各项数据（如试验人员、项目名称和简述等），同时将单次测试总时间设为300 s，数据显示间隔设为3 s；打开摄像头，调节光线亮度与试验箱的位置。进行区域设定，选择25 宫格模式，确定站立区和中心区域比例（见图1 B）；最终设定标尺。设置完成后，点击“开始试验”，填写动物编号、温度、湿度等试验参数。而后将ICR 小鼠背对试验人员放入旷试验箱中央，点击“确定”命令，即可通过视频行为分析系统观察和记录受试小鼠在旷场试验箱内5 min 的活动情况，观察、记录指标包括：运动距离、静止时间、运动时间、区域分布指标（四边、四角、中央的活动情况）、站立次数、运动轨迹等。

1.3.2 高架十字迷宫测试

除区域设定出2 条开臂和2 条闭臂（依次编号为1、2、3、4）以及中心区域（编号为5）外（见图2 B），PMT-100 系列十字迷宫视频分析系统试验操作程序大体同上。受试小鼠放置于中间区域（面向开臂），点击“确定”命令，即可通过视频行为分析系统观察和记录受试小鼠在高架十字迷宫内5 min 的活动情况，观察、记录指标包括：运动距离、静止时间、运动时间、区域分布指标（开臂、闭臂、中央的活动情况）、开臂进入次数、运动轨迹等。

1.4 统计处理

所有数据使用GraphPad Prism（La Jolla，CA，USA）软件进行分析，并作图，所有数据以平均数±标准误（x±SEM）表示，比较分析用One-way ANOVA分析方法，P<0.05 有统计学意义。

图3 旷场试验中小鼠活动轨迹图Fig.3 Mouse activity of trajectory map in open field test

2 结果

2.1 ICR 小鼠旷场试验测试结果

在这里我们展示了ICR 小鼠在旷场试验中的运动轨迹，以便更加直观地表现出小鼠的运动和区域分布状态。因篇幅的原因并未全部列出，但这些图片具有较好的普遍性和代表性，见图3。

旷场试验中各项指标的测试结果及其95%置信区间见表1。

ICR 小鼠在旷场试验中的性别差异如图4 所示，雌、雄ICR 小鼠在运动时间、静止时间、各区域滞留时间、运动距离和站立次数等指标中均无明显差异。

表1 ICR 小鼠开场实验测定结果及95%置信区间Table 1 Open-field test results of ICR mice and their reference ranges

图4 ICR 小鼠在旷场试验中各项指标的性别差异Fig.4 Gender differences of ICR mice in open field test

2.2 ICR 小鼠高架十字迷宫测试结果

ICR 小鼠在高架十字迷宫中的运动轨迹图见图5。

ICR 小鼠在高架十字迷宫中各项指标的测试结果及相应的95%置信区间如表2 所示。

图5 高架十字迷宫小鼠活动轨迹图（部分展示）Fig.5 Mouse activity trajectory map in plus maze test（partial display）

表2 ICR 小鼠高架十字迷宫测定结果及95%置信区间Table 2 Plus maze test results of ICR mice and their reference ranges

ICR 小鼠在高架十字迷宫中的性别差异如图6所示，雄、雌ICR 小鼠在各区域滞留时间、运动距离和进入次数等各项指标中均无明显差异。

图6 ICR 小鼠在高架十字迷宫试验中各项指标的性别差异Fig.6 Gender differences of ICR mice in plus maze test

3 讨论

旷场试验是评价啮齿类动物运动功能和焦虑状态的经典行为学方法之一，其原理是基于啮齿类动物的趋触性，即啮齿类动物同时有畏惧空旷场地和探索行为新事物、新环境的天性，而在开阔的场地中其活动呈现趋避性。旷场试验中常用小鼠的水平活动反映其运动活性，即自主活动能力；垂直运动反映小鼠对新异环境的探索程度，即探索行为行为[3]。研究的旷场试验中静止时间、运动时间和运动距离定是小鼠自主活动能力的主要评定指标；站立次数是小鼠探索行为行为的主要评定指标，虽然中央区域活动频率也可以评价小鼠的探索行为，但我们考虑到小鼠的活动特性后并未使用。这些指标的测定结果和参考范围并未与前人部分研究的结果完全一致[4-6]，这可能是因受试小鼠的品种[6-8]、周龄和体重等关键因素不同而产生了一定的影响。除此之外，我们认为更主要的原因是这些研究各自侧重点有所不同，其研究人员针对旷场试验进行了一定的修整。例如，在林晓春[4]的研究中，其测定时长仅设置为3 min，即使受试动物为大鼠，也导致其测定结果低于试验；而在李腾飞[5]的试验中，结合其测定时长和小鼠活动先强后弱的时相特点[9]考虑后，可以认为其结果与试验高度符合。另外，各个研究中使用的数据采集软件与试验中采用的也有所不同，这也是一个不可忽视的因素。旷场试验的中央、角落和周边滞留时间及其与总时间百分比也可以作为小鼠的焦虑情绪评定指标[5，10]，但为避免受到小鼠的趋避性和活动时相特点的影响，焦虑样情绪由高架十字迷宫和高架零迷宫搭配进行测定并讨论，这样一来更为合理。因为两者的结果具有一致性，可以相互印证，能够更好地反应动物焦虑的程度。因此，在这里对旷场试验的相关结果只做了展示而未进行深入讨论。

高架十字迷宫试验是国际公认的动物焦虑行为测评的装置[11]，自发明以来就被广泛应用于大、小鼠的焦虑行为学研究，其原理是基于动物对新环境的探索行为和对高悬开放臂的恐惧而形成的矛盾冲突状态，进而反映出动物的焦虑情绪[12]。试验的高架十字迷宫试验中选择了小鼠进入开臂和闭臂的次数、滞留时间和滞留时间与总时间百分比作为动物焦虑表现的主要评定指标。这些指标的测定结果和参考范围与前人部分研究的结果虽然仍一定的出入[13]，但考虑到如前所述的原因后，能够认为结果较为一致。同时，我们认为在他们的研究中某些需要注意但极易忽略的操作可能并未得到较好的控制。例如，试验开始时，是按人员需要手持小鼠使其背对实验者放置在开臂与闭臂的接合处，且让小鼠面对开臂。倘若面对闭臂，因小鼠嗜暗的天性（闭臂）[12]，结果将受很大影响；同时，同一试验中所有小鼠均需面对同一开臂且装置放置位置相对固定，否则可能会导致数据产生偏差，这也可能是某些数据离散程度较大的原因之一。

值得注意的是，虽然雄、雌小鼠本身存在一定的生理差别，但研究通过旷场试验和高架十字迷宫试验并未得出雄、雌鼠ICR 在焦虑样情绪、探索行为行为和自主活动能力上存在性别差异。神经行为学中关于小鼠两性差异的报道不少，但多集中在认知功能[14]这一方面，受试动物也多是药物成瘾[15]、不良刺激和应激状态[16-17]的雄、雌小鼠，正常状态下小鼠神经行为学的两性差异并未得到足够的关注。在刘友平[3]的研究中，虽然与我们所用小鼠品系不同，但也未发现性别对其试验结果有所影响，这与研究结果基本一致。同时，这也可能与试验前期对于小鼠严格管理有一定的关系，比如，筛选并剔除了异常和发情小鼠，避免了动情周期[18]的影响，也一定程度上降低了如雌二醇等雌激素水平波动的影响，而这正是造成大多数研究中两性差异的重要因素之一。

神经行为学试验受到诸多因素的影响，除了动物遗传变异[19]、昼夜节律和动情周期[20]等生物因素外，试验环境、测试条件、操作和人员序等因素也会对其造成不可估量的影响。因此，我们在今后的神经行为学试验过程中应对小鼠的品系，周龄、营养及健康状态、试验环境适应程度等严格把控，确保如试验时间段、试验人员、灯光和光照强度[20]、气味[21]、甚至垫料[22]等试验条件一致。只有这样才能科学的获得有效数据；同时，在对试验结果进行比较、参考时，我们也应留意这些因素的差异及其导致的改变，并作出适当的调整。

4 结论

综上所述，研究采用TM-Vision 系列行为学试验系统进行视频采集、参数记录和统计，其灵敏度较高，能够提取客观定量数据；同时，研究的样本量丰富，试验相关因素控制精确，测定结果稳定，数据具有较好的重复性和可信度，可以为今后的情绪障碍和感觉运动这两大类神经行为学研究提供有价值的参考。另外，基于试验的结果，我们也认为雄、雌ICR小鼠在本试验条件下其焦虑样情绪、探索行为和自主活动能力不存在两性差异。