日本沼虾肌抑素前体肽在枯草芽孢杆菌的表达及其对生长效果的影响

章晓栋 沈文英 任 岗

(绍兴文理学院生命科学学院生物系, 绍兴 312000)

肌抑素(Myostatin, MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子[1], 抑制成肌细胞的增殖和分化[2]。肌抑素前体蛋白由信号肽、编码前体肽的N-末端区和编码成熟肽的C-末端区三部分组成, 经两步蛋白酶切转化成成熟的肌抑素[3,4]。肌抑素前体肽(Myostatin propetide, MSTNpp)在酶切分泌后通过非共价相互作用, 与成熟肽间形成复合物, 抑制成熟肽与其受体的结合, 阻断肌抑素的信号转导通路,从而抑制肌抑素生物活性, 促进肌肉生长[5]。研究表明, 过表达肌抑素前体肽或将肌抑素前体肽注入小鼠均可有效促进肌肉生长, 表现出骨骼肌的“双肌”现象[6,7]。在斑马鱼胚胎发育中过表达肌抑素前体肽, 骨骼肌肌纤维数量显著增加, 胚胎体型大、生长加快[8]。相对于脊椎动物中肌抑素及前体肽的深入研究, 无脊椎动物肌抑素的研究较少。目前只在海湾扇贝(Argopecten irradians)[9]、斑节对虾(Penaeus monodom)[10]、大西洋龙虾(Homarus americanus)[11]、日本长额虾(Pandalopsis japonica)[12]、日本沼虾(Macrobrachium nipponenese)[13]等物种克隆得到肌抑素基因。研究表明, 在蜕皮阶段,大西洋龙虾、日本长额虾、日本沼虾等肌抑素基因表达下调, 促进间歇性快速生长[11—13]。而关于无脊椎动物肌抑素前体肽的研究尚未见报道。

日本沼虾(M. nipponenese)是我国养殖面积最广、产量最大的淡水经济虾类。在日本沼虾养殖中, 存在生长缓慢、个体小型化、性早熟等现象[14],导致生长速度和生产性能低下, 养殖总产量不高。目前, 主要通过遗传育种和饲料研发等手段改良日本沼虾性状, 提高养殖规格和效益[15,16]。本研究从日本沼虾肌肉生长调控角度探讨促进生长的途径,在前期日本沼虾MSTN全基因的克隆和表达特性研究[13]基础上, 采用枯草芽孢杆菌表达体系表达日本沼虾肌抑素前体肽, 分析其对生长的影响, 为阐明日本沼虾肌抑素前体肽对肌肉生长发育的调节机理及其在养殖中的应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、枯草芽孢杆菌WB800, 均为本实验室保存。穿梭分泌性表达载体pGJ105, 为本实验室构建。

1.2 穿梭分泌性表达载体的构建

根据日本沼虾MSTNpp原始基因序列特征, 按照枯草芽孢杆菌的偏爱密码子对MSTNpp基因序列进行优化合成(上海生工, 上海)BsMSTNpp, 并亚克隆到pET28a(NdeⅠ/XhoⅠ), 获得质粒pET28a-BsMSTNpp。根据优化合成基因全长序列, 设计表达引物, 上游引物为P001CF： 5′-GGCAACCGCCTCT GCAGCGCAGAAAAGCCACGGGAAAAC-3′, 下游引物为3pETR： 5′-TCATTAAGCTTGTCGG GATCCGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGG-3′, 下划线为同源重组片段。以质粒pET28a-BsMSTNpp为模板, 目的基因全长序列951 bp, 反应体系为50.0 μL。PCR反应条件： 98℃, 5min; 98℃,10s;55℃, 10s; 72℃, 60s; 5个循环; 98℃, 10s; 58℃, 30s;72℃, 60s; 30个循环; 72℃延伸10min, 并进行PCR产物切胶回收。

枯草芽孢杆菌的表达载体pGJ105用PstⅠ和BamHⅠ进行双酶切, 酶切产品切胶回收, 将纯化后的PCR产物2.5 μL与载体酶切产物pGJ105(PstⅠ-BamHⅠ)2.5 μL、Gibson Assembly Master Mix(2×,NEB, E5510S)5 μL, 置于PCR仪中50℃反应15min,进行同源组装, 连接产物转化DH5α, 筛选并测序获得重组质粒pGJ105-BsMSTNpp。

1.3 MSTNpp基因在枯草芽孢杆菌中的表达及鉴定

通过二步法[17]制备枯草芽孢杆菌感受态细胞。将构建成功的重组质粒pGJ105-BsMSTNpp转化进入枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞中; 通过PCR和酶切鉴定, 挑选阳性转化子。将阳性克隆转接到发酵培养基(SpcR, 100 ng/mL)中, 在30℃, 180 r/min培养至24h, 收集上清液, 以含pGJ105空质粒的WB800菌株作为对照, 通过Western blot检测目的蛋白的表达。

取不同时间的发酵液上清进行Western blot分析, 检测重组BsMSTNpp的表达和分泌的时间动态情况。

1.4 MSTNpp重组枯草芽孢杆菌菌剂和饲料的制备方法

重组枯草芽孢杆菌接种于枯草发酵培养基中,30℃, 180 r/min培养24h离心取菌泥, 37℃恒温干燥至恒重, 与白炭黑、玉米淀粉按1：0.5：4的质量比混合制成干菌粉, 干菌粉中重组枯草芽孢杆菌活菌数为109cfu/g。将枯草芽孢杆菌工程菌按照日本沼虾饵料的0.5‰、1‰的比例加入日本沼虾饵料中, 用α淀粉粘合、搅拌均匀, 风干, 再喷洒5‰的橄榄油包被, 风干后4℃保存备用。

1.5 MSTNpp枯草芽孢杆菌投喂日本沼虾养殖实验

选择平均体重为(1.52±0.11) g, 平均体长为(4.55±0.21) cm的健康日本沼虾, 随机分为4组, 每组3个重复, 每个重复200尾, 养殖于体积为1 m3的水泥池中, 实验期间保持养殖水温为(24±3)℃, 日投喂量为虾体重的2%, 试验开始前暂养1周。在日本沼虾基础饲料中添加0.5‰和1‰重组枯草芽孢杆菌菌剂, 分别作为实验组1和实验组2; 投喂无任何添加的日本沼虾基础饲料, 作为对照组1, 在日本沼虾基础饲料中添加1‰空白枯草芽孢杆菌生物制剂(不表达MSTNpp的空白枯草芽孢杆菌), 作为对照组2;实验周期为30d。实验开始前和结束时测定日本沼虾体重, 计算特定生长率(Special growth rate,SGR)和增长率。SGR(%)=(LnWt-LnW0)/T×100%; 其中Wt,W0分别表示平均终末体重(g)、平均初始体重(g);T表示饲养时间(d)。增长率(%)=[(实验组或对照组2SGR-对照组1SGR)/对照组1SGR]×100%。

实验结束取日本沼虾肌肉组织, 称重, 按1﹕9的比例加入PBS, 冰浴条件下匀浆, 制备成10%的组织匀浆, 2500 r/min, 离心10min, 取上清测定肌酸激酶活性, 肌酸激酶(CK)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司(南京)。

1.6 数据处理

实验数据采用平均值±SD表示, 利用DPS软件处理数据,P＜0.05表示存在显著性差异。

2 结果

2.1 BsMSTNpp表达载体的构建

以质粒pET28a-BsMSTNpp为模板, P001CF(PstⅠ)和3pETR(BamHⅠ)为引物扩增优化好的BsMSTNpp基因, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 目的条带大小约1000 bp, 与预期结果(951 bp)相符。采用PstⅠ和BamHⅠ双酶切pGJ105质粒, 分别回收酶切产物和PCR片段, 通过同源组装连接后转化, 双酶切和PCR鉴定阳性重组子, 送阳性克隆进行测序鉴定, 测序正确得到BsMSTNpp重组表达质粒pGJ105-BsMSTNpp (图1)。

图1 重组质粒pGJ105-BsMSTNpp和目的基因PCR电泳Fig. 1 PCR of recombined pGJ105-BsMSTNpp and BsMSTNpp gene

2.2 BsMSTNpp基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将重组质粒pGJ105-BsMSTNpp转化到枯草芽孢杆菌宿主菌WB800, 培养24h后, 收集上清液进行Western blot鉴定, 结果显示阳性菌上清中有与预期大小相近的条带, 由于融合了His.Tag的一段序列,所以重组蛋白理论分子量约36.0 kD (图2)。

图2 重组菌发酵上清Western blot鉴定Fig. 2 Western blot analysis of the supernatant samples

2.3 BsMSTNpp基因在枯草芽孢杆菌分泌表达时间动态

取不同时间的发酵液上清进行Western blot鉴定分析, 检测重组BsMSTNpp的表达和分泌情况(图3)。在发酵液的上清中, 在培养24h后开始出现重组BsMSTNpp的表达条带, 从条带的灰度分析可见, 重组BsMSTNpp随着时间的延长, 其表达量逐渐在升高。在检测的时间范围内, 在分泌上清中100h后达到最高值, 重组BsMSTNpp的表达量相对于24h约提高了10倍。

2.4 肌抑素前体肽对日本沼虾生长和CK酶活力的影响

养殖实验结束后测定日本沼虾特定生长率, 对照组1、对照组2、实验组1和实验组2日本沼虾SGR分别是2.88%、3.00%、3.17%和3.31% (表1)。添加0.5‰和1‰表达MSTNpp的重组枯草芽孢杆菌的实验组日本沼虾SGR显著高于对照组1(P＜0.05),分别提高10.1%和14.9%; 实验组日本沼虾SGR均高于对照组2, 但不存在显著性差异。日本沼虾肌酸激酶活性测定结果表明, 实验组1和实验组2的CK酶活性显著高于对照组(P＜0.05), 表明重组表达MSTNpp枯草芽孢杆菌能有效提高日本沼虾CK酶活性。推测重组表达的MSTNpp可能通过促进肌细胞增殖和分化提高肌肉组织生长, 从而进一步影响日本沼虾生长速度。

图3 不同发酵时间WB800 [pGJ105-BsMSTNpp]上清中BsMSTNpp的Western blot分析Fig. 3 Western blot analysis for recombined BsMSTNpp expression

3 讨论

枯草芽孢杆菌(B. subtilis)具有较清楚的遗传背景、良好的分泌性和无致病性等优点, 将其芽孢制备成口服制剂能够耐受胃肠道环境, 目前已作为重要工业菌种应用于水产、畜牧养殖业, 被批准为食品级安全菌株[18]。和大肠杆菌表达系统相比, 枯草芽孢杆菌胞壁不含内毒素, 简化了表达产物的纯化和回收; 和酵母表达系统相比, 枯草芽孢杆菌培养成本低, 发酵周期短[19,20]。但枯草芽孢杆菌表达系统存在一个限制因素, 即生长到对数末期时会分泌表达多种胞外蛋白酶, 导致目的蛋白降解。Bol-huis等[21]利用基因失活的突变方法, 成功构建一株在野生菌株的基础上缺失了8个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌WB800, 该蛋白酶缺陷菌株胞外蛋白酶的活力只有野生型的0.32%, 克服了表达蛋白降解及不稳定等问题。近年来, 随着枯草芽孢杆菌表达系统的完善, 越来越多地应用于饲用酶、饲用代谢产物、抗菌肽、药用蛋白、抗原蛋白的生产[22—25]。由于大部分枯草芽孢杆菌不含内源性质粒, 体外连接的双链质粒DNA分子直接转化宿主效率很低, 因此构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体十分必要[26—28]。本研究根据枯草芽孢杆菌表达系统的特点, 对日本沼虾MSTNpp基因序列进行了优化, 同时为提高转化效率, 构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ105, 构建重组表达载体pGJ105-BsMSTNpp, 成功地在枯草芽孢杆菌WB800中表达了日本沼虾肌抑素前体肽基因, 经过Western blot检测到大小为36.0 kD的表达产物。本研究采用了组合型启动子PrapA, 不需要诱导物, 重组蛋白可以持续表达[27], 通过分析发酵时间对重组BsMSTNpp表达量的影响, 结果表明发酵时间与重组BsMSTNpp表达量成正相关。

为验证表达产物的生物活性, 本实验将表达有MSTNpp的枯草芽孢杆菌工程菌添加到日本沼虾饲料进行投喂。结果表明, 枯草工程菌能够有效提高日本沼虾的肌酸激酶活性和特定生长率, 促进日本沼虾生长。大量研究表明枯草杆菌可以提高草鱼、凡纳滨对虾等水产养殖动物的生长性能[28—31]。在本研究中, 实验组日本沼虾特定生长率显著提高,但和对照组2间不存在显著性差异, 可能与养殖周期不够长有关。在小鼠和斑马鱼的研究表明, 过表达肌抑素前体肽可以有效促进骨骼肌细胞的增殖和生长[6—8]。CK又叫磷酸肌酸激酶(Creatine phosphokinase, CPK), 催化肌酸转换成磷酸肌酸, 消耗三磷酸腺甘(Adenosine triphosphate, ATP)生成二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP), 是肌肉组织代谢的关键酶, 在成肌细胞增殖和分化过程中能快速合成肌酸激酶[32], CK已成为直接测定肌细胞增殖和分化能力的特异性指标[33,34]。本研究结果表明重组表达MSTNpp枯草芽孢杆菌能有效提高日本沼虾肌酸激酶活性, 证明日本沼虾肌细胞的增殖和分化能力增强了。推测重组表达的MSTNpp可能通过促进肌细胞增殖和分化提高肌肉组织生长,从而进一步影响日本沼虾生长速度。

表1 MSTNpp重组蛋白对日本沼虾生长率和肌酸激酶活性的影响Tab. 1 Effects of recombined MSTNpp on growth rate and creatine kinase activity

4 结论

本实验采用枯草芽孢杆菌系统对日本沼虾MSTNpp进行表达, Western blot检测到重组MSTNpp蛋白分子量约为36.0 kD。为进一步研究MSTNpp对日本沼虾生长的作用机理提供了基础。将重组枯草芽孢杆菌投喂日本沼虾30d, 验证表达产物的生物活性, 结果证明重组表达MSTNpp枯草芽孢杆菌能提高日本沼虾CK酶活性, 促进肌细胞增殖和分化, 进一步影响生长速度。为肌抑素前体肽进一步应用于日本沼虾养殖提供了实验基础。