基于网络药理学和分子对接研究三子养亲汤治疗支气管哮喘的作用机制

陈达艳 顾万红 马新换

甘肃省中医院，甘肃 兰州730050

支气管哮喘是临床比较常见的疾病。哮喘属于中医“哮病”范畴，风痰阻肺是其病机。三子养亲汤来源于《韩氏医通》，具有祛风化痰、降气平喘的功效。药理研究发现［1］，三子养亲汤具有抗炎、止咳、平喘、祛痰的药理作用，作为治疗支气管哮喘的常用方剂。

网络药理学是近年来发展起来的新型学科，已被广泛用于中药活性成分的筛选、作用靶点的预测、中药作用机制及疾病发生机制的推测［2-4］。分子对接技术被用于理论验证受体与药物分子之间结合模式和亲合力［5-8］。本研究基于网络药理学和分子对接技术，探讨三子养亲汤治疗支气管哮喘的潜在治疗作用，为三子养亲汤的临床应用和研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 三子养亲汤活性成分的搜集、筛选和成分靶点预测 通过TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“紫苏子”“莱菔子”“芥子”为关键词，检索各中药的化学成分，并以OB≥30%、DL≥0.18作为筛选条件，得到活性成分［5-8］。同时，在TCMSP数据库Targets Information项下得到活性成分对应的靶标蛋白，并借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库转化为基因名。

1.2 疾病靶点预测 通过GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（https：//omim.org/），获取支气管哮喘的靶点基因。

1.3 网络构建 用R软件，获取疾病与成分的共同靶点。将共同靶点导入STRING在线软件，物种选为homo sapiens，最高置信度设置为0.9，去掉游离节点，获得PPI网络图。用Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑分析，以种节点度（degree）值大于中位数作为筛选条件，确定关键靶点，探讨三子养亲汤的潜在物质基础和治疗支气管哮喘的关键靶点，并建立三子养亲汤药物-成分-靶点-疾病网络。

1.4 GO和KEGG分析 使用David［9］（https：//david.ncifcrf.gov/）对网络中的共同靶点进行GO和KEGG分析。GO分析选择生物过程（BiologiclProcess，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3个模块绘制成条形图，并以P＜0.05作为显著功能与通路的临界值。通过R软件，安装相应的安装包，将生物通路图制成气泡图。

1.5 成分-靶点分子对接 分别从RSCB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）和Pub Chem数据库（https：//pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载筛选出的关键靶点和化合物的3D结构，并转化为Pdb格式；使用AutoDock软件分别加氢、加电子等操作，分子对接设置蛋白结构为刚性大分子，分子为柔性，算法为Genetic Algorithm；用Pymol对得到的对接结果进行绘图。参照文献，以结合能≤-5.0kJ/mol［5-8］的成分作为三子养亲汤治疗支气管哮喘的活性成分筛选依据。

2 结果

2.1 三子养亲汤活性成分筛选 通过检索TCMSP数据库，结合“OB≥30%”与“DL≥0.18”检索到紫苏子、莱菔子、芥子中活性化合物共22个，其中16个来自紫苏子，3个来自莱菔子，3个来自芥子。见表1。

2.2 三子养亲汤活性成分靶点预测结果 从TCMSP数据库检索得到的紫苏子、莱菔子、芥子的靶点，利用Prel处理，获得三子养亲汤的活性靶点201个，其中179个来自紫苏子，18个来自芥子，4个来自莱菔子。

2.3 疾病靶点预测结果 通过GeneCards、OMIM数据库检索支气管哮喘，共得到2210个与支气管哮喘相关的靶点。

2.4 网络构建结果 用R软件建立“成分-靶点”网络与“疾病靶点”相互交集的韦恩图，见图1。共有93个交集靶点，是三子养亲汤治疗支气管哮喘的候选靶点，其中NCOA2、ADRA1A、ADRA1B、AR、CHRM1、CHRM2、CHRM3、OPRM1、PTGS1、PTGS2为紫苏子和芥子的共同靶点基因；NCOA2、NR3C2、PGR为紫苏子和莱菔子的共同靶点基因。用Cytoscape 3.7.2软件建立三子养亲汤药物-成分-靶点-疾病网络，该网络包括106个节点，249条边，见图2。网络拓扑分析中，网络中度值＞中位数（中药度值中位数=6，成分度值中位数=19，靶点度值中位数=6）的药材有1个（紫苏子），成分有4个，靶点有5个。排名前3位的化合物分别是MOL000006-木犀草素、MOL001439-花生四烯酸、MOL002773-β-胡萝卜素，度值分别为44、25、22，均来自紫苏子；排名前3位的靶点分别是NCOA2、PGR、PTGS2，度值分别为12、11、10，为网络中的关键节点。见表2。

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2.5 靶点通路分析 利用DAVID在线工具对三子养亲汤治疗支气管哮喘的93个关键靶点进行GO和KEGG分析（P<0.05）。GO分析得到条目523个，其中生物过程（BP）396个，细胞组成（CC）53个，分子功能（MF）74个，分别占76%、10%、14%。在生物过程中，凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、一氧化氮生物合成过程正调控（positive regulation of nitricoxide biosynthetic process）、血管收缩正调控（positive regulation of vasoconstriction）等排位靠前；在细胞组分中，膜筏（membraneraft）、细胞外间隙（extracellular space）、胞质溶胶（cytosol）等排在前面；在分子功能中，主要包括酶结合（enzyme binding）、同一蛋白结合（identical protein binding）、蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity）等。选取排名前20位的条目绘制成条形图，见图3。

图1 VEEN图

图2 三子养亲汤药物-有效成分-靶点-疾病网络

图3 Go富集分析

KEGG通路分析结果显示，富集于144个信号通路中，以排位前20条信号通路（P＜0.05）绘制的高级气泡图及柱状图见图4。结果显示三子养亲汤治疗支气管哮喘KEGG通路分别与PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、癌症中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）等多条通路有关，其中PI3K-Akt信号通路涉及CHRM1、CHRM2、RELA、CCND1、MAPK1等基因；人巨细胞病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因；卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染涉及PTGS2、RELA、CCND1、MAPK1、CASP3等基因；癌症中的蛋白聚糖涉及PLAU、CCND1、MAPK1、CASP3、COL1A2等基因；前列腺癌涉及PLAU、RELA、CCND1、MAPK1、EGF等基因。见图4、5。这些通路与支气管哮喘的形成机制有着密切的联系，有研究显示这些通路直接或间接介导并参与支气管哮喘的发生发展过程。上述结果表明三子养亲汤主要化学成分的作用靶点涉及的生物学过程多样化，并分布于不同的代谢通路，体现了其多成分，多靶点，多途径的治疗特点。

2.6 分子对接结果 将3个核心活性化合物木犀草素、花生四烯酸、β-胡萝卜素分别与3个关键靶点NCOA2、PGR、PTGS2进行分子对接。以结合能≤-5.0kJ/mol作为筛选标准，可知，三子养亲汤中木犀草素、β-胡萝卜素与关键靶点结合能均小于-5.0kJ/mol，构象能量低，结构稳定，结合活性较高。见表2和图6。

图4 KEGG富集分析的20条通路（气泡图及柱状图）

图5 PI3K-Akt信号通路

3 讨论

3.1 三子养亲汤治疗支气管哮喘活性成分 本研究共筛选出三子养亲汤中可被口服吸收的22个活性成分，其中16个来自紫苏子，3个来自莱菔子，3个来自芥子。紫苏子化合物中，黄酮类化合物有木犀草素，脂肪酸类化合物有花生四烯酸、顺式-11-二十碳烯酸、二十碳三烯酸，甾醇类化合物有β-谷甾醇、豆甾醇、菠甾醇，脂肪族化合物有2，6，10，14，18-五甲基-2，6，10，14，18-戊烯、24-甲基异戊酚等。研究表明紫苏叶的挥发油成分、黄酮类和酚酸类化合物是其抗炎活性的主要物质基础，已明确的活性成分有木犀草素。三子养亲汤平喘配伍量效关系研究结果［10］表明，紫苏子是方中平喘的主要中药，且平喘效果与用量有关联性。另有研究表明［11］，三子养亲汤的平喘作用优于各单味药，紫苏子的平喘作用强于芥子，芥子的祛痰作用强于紫苏子，莱菔子的镇咳作用较强。这与本研究筛选出的结果相吻合，也与三子养亲汤的传统功效一致，是三子养亲汤传统功效的主要药效物质基础，也是三子养亲汤质量标志物筛选的主要途径和重要依据。

表2木犀草素、β-胡萝卜素、花生四烯酸与NCOA2、PGR、PTGS2的结合能

图6 木犀草素、β-胡萝卜素、花生四烯酸分别与NCOA2、PGR、PTGS2的分子对接模式

3.2 三子养亲汤治疗支气管哮喘潜在作用靶点 本研究表明，核受体辅激活因子2（NCOA2）、PGR、PTGS2是三子养亲汤治疗支气管哮喘互作网络中排名前3的靶点，其中NCOA2、PTGS2为紫苏子和芥子的共同靶点基因；NCOA2、PGR为紫苏子和莱菔子的共同靶点基因。NCOA2为3味中药的共同作用靶点，PTGS2为木犀草素、花生四烯酸、β-胡萝卜素的共同作用靶点。说明三子养亲汤中不同成分具有共同或相似的靶点，这与中药配伍的相使思想一致，这些靶点是三子养亲汤治疗支气管哮喘关键靶点。NCOA2是p160甾体受体辅活化子（SRC）家族的一员，在许多生理和病理过程中发挥着重要作用，包括发育、内分泌调节和肿瘤发生。PGR即为孕激素受体，临床研究发现月经期哮喘患者雌激素升高和孕激素降低可增强气道高反应性，可能是月经期哮喘的原因［12］。孕激素和雌激素可以降低重症哮喘患者let-7fmicroRNA的表达和增加IL-23/IL-23信号表达和IL-17A表达，也可能是女性重症哮喘患者多于男性的原因［13］。

前列腺素内过氧化物合酶（PTGS），又称环加氧酶，有组成型PTGS1（又称COX1）和诱导型PTGS2（又称COX2）两种同工酶，它们在表达和组织分布的调节上存在差异。COX-2参与花生四烯酸代谢成各种PGI产物，能诱发哮喘急性发作［14］。COX-2也能诱导分泌IL-18、前列腺素等炎症介质，加重炎症反应，诱发哮喘或使哮喘加重。炎性细胞因子、生长因子等均能诱导COX-2的表达［15］。

3.3 三子养亲汤治疗支气管哮喘的机制 哮喘与炎症、细胞因子有关。研究发现，木犀草素可通过抑制COX-2［16］的表达从而减少PGE2的生成；能显著减轻活化的巨噬细胞的炎性反应，下调IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎因子的表达。木犀草素能减少活性氧和活性氮的生成，抑制炎性细胞［17-18］因子和炎症介质的表达，从而缓解炎症反应。在哮喘的病理生理过程中，研究表明，PI3K通过影响炎症细胞的募集、激活、凋亡及细胞因子的产生而发挥着重要作用。在哮喘发生的炎症过程中，T细胞扮演着重要作用，哮喘发病机制与Th1/Th2细胞在数量、活化及功能方面的比例失衡有密切的关系。研究推测，PI3K信号通路通过参与Th1/Th2的失衡，而参与哮喘发病过程［19］。本研究结果显示三子养亲汤治疗支气管哮喘涉及的最主要通路为PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway），这与文献报到相一致。

3.4 分子对接 从网络药理学分析和分子对接结果可知，与关键靶点NCOA2、PGR、PTGS2的亲和力，三子养亲汤中木犀草素、β-胡萝卜素比临床常用化学药沙丁胺醇、氨茶碱的低，表明结构稳定，结合活性较高，对于治疗支气管哮喘因该有较好的疗效，可能是潜在物质基础。

综上，本研究发现三子养亲汤中的核心活性成分木犀草素、β-胡萝卜素作用于NCOA2、PGR、PTGS2等多个靶点，调节PI3K-Akt等多条信号通路，从而发挥治疗支气管哮喘的作用，为进一步研究三子养亲汤药理药效机制提供了思路和科学依据。