衰老病理机制与川产道地药材黄连的抗衰老效应研究进展

蒙雨丹　吴诗惠　龚晓丽　赵军宁　李晓鲁

摘要 黄连作为川产道地药材在中医药历史上有重要地位。现代药理研究证明，黄连及其提取物在抗衰老、抗炎、抗肿瘤、调血脂、降血糖、神经保护等方面具有广泛的药理作用。衰老及其相关疾病在现代医学发展中具有重要意义，黄连及其提取物在抗衰老及衰老相关性疾病方面的效应及机制的研究进展，对发掘川产道地药材黄连的治疗新功效及新靶点，为其抗衰老新用途提供理论依据，为衰老及其相关疾病的临床治疗提供现代的科学依据及临床转化可能。

关键词 黄连;生物碱;小柴碱;衰老;抗衰老;衰老相关性疾病;效应;机制

Abstract Rhizoma Coptidis has an important position in the history of traditional Chinese medicine as a native medicinal material in Sichuan. Modern pharmacological research has further proved that the related biologically active components in Rhizoma Coptidis and its extracts have a wide range of pharmacological effects， which have a clear role in anti-aging， anti-inflammatory， anti-tumor， blood lipid regulation， hypoglycemic， neuro-protection. The effects and research progress of Rhizoma Coptidis and its extracts in anti-aging related aspects are highlighted by us. We look forward to discovering new therapeutic effects and new targets for the Chinese medicinal herbs Rhizoma Coptidis from the Sichuan. Secondly， it provides theoretical basis for new uses and further provides modern scientific basis for clinical applications.

Keywords Rhizoma Coptidis; Alkaloid; Berberine; Aging; Anti-aging; Aging-related diseases; Effect; Mechanism

中圖分类号：R285.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.02.015

黄连（Rhizoma Coptidis，RC）又名川连、川黄连、姜制黄连、姜连、萸连等，是我国最常用的川产道地药材之一，始载于《神农本草经》，其味苦，性寒。归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。能清热燥湿、泻火解毒，用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐[1-2]。黄连主要来源于毛茛科植物黄连（CoptischinensisFranch）、云连（Coptisteeta Wall）或三角叶黄连（CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao）的干燥根茎，以上3种分别习称“味连”“云连”“雅连”，主要分布于我国湖北、云南、四川等地。

雅连为四川著名道地药材，《本草纲目》记载“今虽吴蜀皆有，惟以雅州，眉州者良”。据记载1740年雅连已栽培于当时的峨眉山龙池、净水，洪雅县之张村、高庙等乡。雅连中含有多种生物碱，包括表小檗碱（含0.20%～0.68%）、黄连碱（含1.03%～1.62%）、巴马汀（含0.75%～2.11%）和小檗碱（含4.86%～6.17%）4种生物碱，至于是否含有药根碱还有待继续研究[3]。其主要成分小檗碱，赋予了它多种药理学作用。小檗碱又称黄连素，最初于19世纪初被分离并鉴定为植物异喹啉碱生物碱，除抗菌效用外还具有广泛的药理作用，在衰老及其相关疾病，如：高血压、高血糖、高脂血症、癌症、心律失常、抑郁、阿尔茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）等[4-7]都有明确的作用。研究发现，黄连的这些作用主要归因于其生物碱成分，尤其是异喹啉生物碱（小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱[8]。

本文重点关注黄连及其提取物抗衰老的效应及相关信号通路，旨在挖掘其潜在的机制和途径，为预防衰老与治疗相关的疾病提供科学依据。

1 衰老对人体健康的影响

持久性衰老细胞是在与人类健康有关的至少3种情况下产生的：正常衰老，与衰老有关的疾病和治疗干预措施。在衰老的个体中，由多种机制引起的衰老细胞残留会使衰老的组织功能降低，同时面对其他压力时更容易进一步恶化。

1.1 自然衰老 1881年进化生物学家Weismann在其论文《生命的持续时间》中提出了一个被认为是激进主义的观点：“之所以会发生死亡，是因为一个破旧的组织无法永远自我更新，并且因为通过细胞分裂来增加的能力不是持久的而是有限的”。直到1961年Hayflick在证明哺乳动物细胞确实确实具有有限的细胞分裂能力，这个概念被称为“Hayflick限制”[9]。自然衰老是由于内在因素引起的，包括：年龄老化，生理老化，皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白合成能力下降，细胞质和细胞间质流动性降低。这种衰老又被称之为固有衰老或者内在衰老，表现为细胞衰老退出细胞周期，该细胞周期的退出受p53/p21CIP1和p16INK4a/Rb肿瘤抑制途径的激活控制[10]。

除了退出细胞周期外，衰老通常伴随着明显的细胞形态变化，衰老的细胞变得扁平、扩大和空泡状，有时出现带有多个或扩大的核;在功能方面，衰老细胞除不能通过增殖促进组织修复外，还通过分泌募集炎性细胞，重塑细胞外基质，触发有害细胞死亡，诱发纤维化和抑制干细胞功能的因子来破坏正常的组织功能。同时衰老细胞还经历了许多其他表型改变，例如代谢重编程、染色质重排或自噬调节等，从而导致疾病风险增加及健康寿命受到威胁。

1.2 衰老相关性疾病 细胞衰老最初被认为是一种细胞内在程序，然而，越来越多的证据表明衰老细胞具有发放信号并影响其周围环境的能力。衰老细胞产生可溶和不可溶因子的复杂混合物，统称为衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP），SASP在转录、翻译等多个水平受到调控。包括转录，翻译，mRNA稳定性和分泌。与青年时期的疾病不同，随着人口的老龄化，与年龄相关的疾病发生在已经因衰老过程，这些“原代”衰老细胞是组织维护固有的正常磨损过程造成的。衰老通过祖细胞停滞以及SASP引起的干细胞和实质细胞功能障碍，降低了组织对引起疾病的压力的抵抗力[11]。随着疾病的发生和发展，病理部位会产生另一些衰老细胞，这样周而复始恶性循环，也部分解释了为什么疾病易感性会随着年龄的增长而增加，疾病的进程会被放大，同时疾病本身也推动着衰老的加速。

目前与衰老相关性疾病的研究主要集中在心血管疾病、癌症、关节炎、痴呆、白内障、骨质疏松症、糖尿病和高血压以及神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases，NDs），例如AD、亨廷顿舞蹈病（Huntington′s Disease，HD）、帕金森氏病（Parkinson′s Disease，PD）和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）等。

1.3 治疗带来的衰老 治疗呈现的效应并非只有有益的一面，例如发生在涉及骨髓移植的小儿血液癌治疗中电离放射或化学疗法会损伤患者的免疫系统，在杀伤癌细胞的同时，会导致细胞衰老和内环境的恶化[12]。经过此类治疗的小儿癌症幸存者表现出过早衰老的迹象[13-14]。这些可能是治疗引起的持续的细胞衰老带来的不良后果，持久性衰老细胞可能通过SASP破坏或损害周围组织。

2 川产道地药材黄连的抗衰老效应

2.1 延长寿命和维护健康 衰老是人类疾病的最大危险因素，因为它会导致细胞生长停滞，组织功能和新陈代谢受损，最终影响寿命。果蝇因其生命周期短、遗传背景简单、转基因技术成熟等优势，一直是衰老基因筛选和功能研究的理想模式生物。Navrotskaya VV[15]等研究发现用黄连的主要成分——小檗碱（1 mmol/L、5 mmol/L）添加到培养基影响果蝇的运动活性和寿命。考虑到高剂量毒性的作用，最终采用1 mmol/L的小檗碱处理培养基，每3～4 d观察并记录1次结果，发现低剂量组可以通过抑制催化色氨酸转化为犬尿氨酸的酶活性来延长雌性果蝇的寿命，同时可刺激果蝇的自发活动。同一研究小组证明小檗碱在高温促衰老果蝇模型中具有保护作用[16]。但在延长哺乳动物寿命中的作用尚未见报道。

2.2 黄连及其提取物对皮肤抗衰老的效应作用 Denham Harman1956年首次提出活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）随着时间的推移而积累，是老化过程的主要贡献者[17]。人体皮肤由外侧的表皮和下方的真皮两层组成，通过基底层相互连接。随着衰老的进展，表皮和真皮皮肤层变薄。由于细胞外基质的破坏，老化的皮肤急剧丢失胶原蛋白I、III和VII，加之弹性纤维和透明质酸的减少而产生细纹。此外随着内在性激素的产生减少和神经末梢的数目减少，皮肤也失去了敏感性[18]。不论是内在固有的衰老因素，还是外在环境影响等都加速着皮肤的老化进程。Kim S[19]等发现黄连及其提取物对皮肤具有特别的抗衰老作用。研究发现，添加有5～100 μmol/L的不同浓度小檗碱的培养基处理48 h，在不影响人正常角质形成细胞活性的条件下，其中浓度为20 μmol/L、100 μmol/L的小檗碱，呈现出剂量依赖性地显著抑制MMP-9和IL-6的表达，可以预防皮肤发炎和细胞外基质蛋白的降解，从而用作抗皮肤衰老产品的有效成分;其次，在皮肤光老化实验中发现，小檗碱可降低人皮肤成纤维细胞中紫外线诱导的MMP-1表达，增加I型胶原蛋白的表达[20]。

2.3 黄连及其提取物在衰老相关疾病中的作用 衰老是一个多因素影响的不可逆的生物学过程，其特征是逐渐失去生理完整性，导致功能受损和脆弱性增加，直至死亡。随着年龄增长及压力的增加，当代人机体的衰老明显加速[21]。身体可能会出现诸如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、营养和代谢性疾病等衰老相关性疾病，任何一种疾病的存在都会增加罹患其他疾病的风险。研究表明使用雷帕霉素、白藜芦醇、烟酰胺衍生物、二甲双胍等物质可通过诱导自噬延缓衰老，延长寿命，并改善衰老过程中的心血管等功能[22-23]。黄连作为天然药物及其提取物被证明在衰老相关疾病的治疗方面具有诸多有益的药理学作用。在降血脂治疗方面，黄连碱被证实具有降低血脂水平作用。高胆固醇血症患者口服黄连素50 mg/（kg·d）3个月可以降低血液总胆固醇29%，甘油三酸酯降低35%，低密度膽固醇（LDL）降低25%[24];在调节血糖方面，黄连碱以剂量每天0.5～1.5 g，分2剂或3剂口服，干预8～24周不等，在临床和实验研究中均被证实具有安全有效的降血糖作用，类似二甲双胍和罗格列酮，试验中未发现严重的低血糖事件，由小檗碱引起的可预见不良反应——便秘是患者可忍受和缓解的。更值得一提的是，它还可以改善糖尿病并发症，包括肾病、内皮功能障碍和神经病变[25-26]。对2型糖尿病患者血糖的影响的研究总结中最新发现，小檗碱与降血糖药物联合使用的降血糖疗效优于单独的小檗碱或者降血糖药物，小檗碱的使用剂量、治疗时间及患者的年龄可能会改变治疗效果[27];在对抗神经退行性疾病方面，与衰老相关的认知能力下降的严重程度易导致神经退行性疾病，例如AD作为痴呆症最常见的原因，是一种不可逆、进行性的神经变性疾病。小檗碱被证实可抑制Aβ生成和老年斑形成，减轻胆碱能缺乏症并改善神经传递，采用20 μg/mL的小檗碱处理表达tau的HEK293细胞模型24 h，显著地降低了Calyculin A诱导的tau过度磷酸化，提示小檗碱可能是AD潜在的治疗药物[28];在心血管保护方面，61名急性冠脉综合征患者，经皮冠状动脉介入治疗后除常规治疗外，接受小檗碱治疗（300 mg，2次/d，持续30 d），与对照组比较，血清中MMP-6、ICAM-1、IL-6、C反应蛋白等显著降低，预示其可作为急性冠脉综合征患者抗炎的辅助疗法[29]。

2.4 黄连及其提取物对细胞早衰的作用 细胞衰老其特征之一是其稳定的细胞周期停滞，衰老的生长停滞通常是由内在因素（氧化损伤、端粒磨损等）或外在因素（紫外线、γ射线照射等）引起的持久性DNA损伤反应（DNA Damage Response，DDR）触发的，是一个恶性循环的过程，表现为反复的细胞分裂和端粒侵蚀以及激活癌基因，染色质结构破坏和氧化应激，使细胞增殖停滞[30]。从而造成组织修复能力丧失，其次，衰老细胞产生促炎性细胞因子和细胞外基质降解酶[31]。细胞形态学的特征与衰老标记的免疫细胞化学检测相结合，例如细胞周期蛋白激酶抑制剂（如p21WAF1的过表达）和rpS6的磷酸化，被认为是衰老细胞最具体的生物标记。在经过早衰的A549细胞培养物中施用小檗碱可以减少衰老表型的发展，通过激活SA-β-gal和诱导的CDK抑制剂p21WAF1、p16INK4A和p27KIP1，小檗碱以浓度依赖的方式明显减少衰老标记检测水平[32]。

3 川产道地药材黄连及其提取物在抗衰老作用中的机制研究

中草药黄连及其主要生物活性成分已被用于与衰老相关的疾病研究，且取得良好效果。这些作用的机制涉及多个细胞激酶和信号传导途径，主要包括相关途径NF-κB/MAPK/PI3K-Akt/AMPK/ERS和氧化应激[33]。

3.1 黄连及提取成分抑制NF-κB通路的分子机制 NF-κB通路在所有有核细胞中表达，与调节细胞免疫、增殖、分化和凋亡等途径有关。与衰老密切相关的过度细胞凋亡和吞噬作用降低，可能导致慢性炎性反应，包括激活NF-κB信号通路，其特征是促炎性细胞因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）的循环水平升高。黄连及提取成分可能通过调节NF-κB途径，发挥抗炎和抗凋亡作用。其机制至少包括以下4个途径：1）抑制包括TLR4、CD14在内的膜受体的活性;2）抑制核因子κB激酶的磷酸化（IKK）;3）抑制NF-κB抑制剂（IκBα）的降解;4）抑制活化的NF-κB进入细胞核及其与DNA的结合活性[4]。

3.2 黄连及提取成分抗炎作用抑制 MAPK途径的分子机制MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。黄连及其提取物可以通过多种途径调节MAPK途径，主要通过ERK（细胞外调节蛋白激酶）、JNK（c-Jun N-末端激酶）和p38这3种途径进行调节，在炎性反应、细胞增殖、分化和凋亡等方面起重要作用。例如，小檗碱可以有效抑制LPS或IFN-γ诱导的BV-2小胶质细胞中ERK的活化来抑制促炎反应[34]。黄连碱可以通过抑制MAPK信号通路的激活，下调IL-6、IL-1β和TNF-α水平，p-p38和p-JNK1/2蛋白表达水平降低。在治疗apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化时，可显著降低粥样硬化斑块面积，达到抗炎降血脂的作用，为黄连碱在动脉粥样硬化和其他慢性炎性反应性疾病的治疗中提供新的应用[35]。

3.3 黄连及其提取物成分调节AMPK途径的分子机制 AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在多种代谢途径中发挥重要作用，包括在细胞水平上调节运动、营养和激素信號，从而控制全身的能量消耗和底物利用率并维持能量代谢的平衡[36]。黄连的活性成分可通过激活包括LKB1在内的上游靶标来部分激活AMPK[34]。激活后，增强了线粒体的生物发生，线粒体的抗氧化保护，并增加了葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达和活性。同时，减少了蛋白质、脂质和碳水化合物的不必要合成。黄连及其提取成分主要发挥以下功能：（A）激活AS160和GLUT4以促进葡萄糖转运;（B）调节PFK-2以促进糖酵解;调节FAS和ACC以抑制糖异生和糖原形成;（C）抑制SREBP1c及其下游PPARγ、FAS和ACC1的抗肥胖作用[37]。

3.4 黄连及其提取物成分调节PI3K-Akt途径的分子机制 PI3K-Akt途径是一个复杂的过程，该途径一旦激活，就会刺激下游信号（例如GSK3β，mTOR，Nrf2等）表现出多种生物学效应。它可以通过调节BAD（Bcl-2的相关死亡启动子）、Bcl-2和caspase-9表达的Akt抑制细胞凋亡;通过控制mTORC1（mTOR复合物1）的表达来调节细胞的生长，该表达控制核糖体的翻译和合成;Akt参与营养吸收和代谢过程及血管生成和细胞迁移[38]。黄连及其提取物可以部分调节PI3K-Akt途径，首先小檗碱通过调节抑制PI3K/AKT/GSK3磷酸化，下调MITF和酪氨酸酶的表达来抑制黑色素的合成和酪氨酸酶的活性。以上这些发现可能有助于小檗碱在预防和治疗皮肤色素沉着症中的潜在应用。通过AKT/ mTOR的/p70S6K的途径调节心脏成纤维细胞增殖，胶原蛋白合成和诱导胃癌细胞凋亡;其次还可以通过增加PI3K/Akt/eNOS的表达来保护内皮细胞免受TNF-α的损害[39-40]。

3.5 黄连及其提取成分调节ERS途径的分子机制 内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）是重要的亚细胞器，可完成蛋白质折叠和修饰。当细胞受到强烈刺激（例如缺氧，葡萄糖饥饿，Ca2+稳态紊乱）时，内质网将积累未折叠/错误折叠的蛋白质并诱导内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）[41]。黄连及其提取物至少可以通过2种途径抑制ERS途径，包括抑制IRE-1的表达和抑制PERK的磷酸化，通过下调ERS途径中的蛋白质（包括PERK，IRE-1α，eIF2α和CHOP）对ER应激相关疾病（包括肥胖症，炎性反应和糖尿病）具有治疗作用[42-43]。

3.6 黄连及提取成分调节氧化应激途径的分子机制 在氧化磷酸化过程中线粒体产生的ROS对DNA造成持续性损伤是衰老的主要机制[44]。DNA双链断裂是由ROS引起的最严重的损伤，修复过程中涉及端粒DNA病变可导致端粒的功能障碍，从而阻碍DNA修复和驱动细胞进行复制衰老。此外，作为许多自由基的前体，超氧化物已被证明可以调节DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化的主要表观遗传过程，所有这些均可促进衰老过程[45]。黄连及其提取物可通过以下机制调节氧化应激反应：（A）ROS的调节/RNS自由基物质，小檗碱通过增加自由基清除活性对抗高反应性过氧亚硝酸盐和羟基自由基可猝灭ROS和活性氮簇（RNS）;（B）调节抗氧化蛋白的生成，包括ROS代谢酶;（C）调节氧化还原敏感转录因子的表达，包括NF-κB、MAPK、AP-1、HIF及PI3K/Akt。（D）刺激Nrf2的转运活性和核积累，并促进Nrf2-DNA结合活性[46]。

4 川產道地药材黄连及其提取物在抗衰老相关疾病作用中的潜在机制

黄连及其提取物在抗衰老相关疾病中的机制研究主要集中在AMPK信号相关通路上。AMPK被认为是细胞的“能量传感器”，因为它可以通过提高AMP+ADP与ATP的细胞比例来激活通路。当（AMP+ADP）/ATP比率增加时，AMPK被激活，AMPK是目前已知的唯一抑制细胞生长和增殖的靶标。

研究表明，黄连及其提取物均可显著地增加高脂饮食喂养小鼠的内脏脂肪组织和肝脏中AMPK的mRNA表达，其发挥AMPK激活作用的机制可能是通过线粒体靶向[47]。其中小檗碱/黄连可以抑制mTOR信号，可能通过调节AMPK信号下游靶标，例如：AMPK通过抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶标的活性来模拟与卡路里限制相关的生长因子下调，小檗碱可能通过调节AMPK/ mTOR信号通路诱导的自噬[48];作为AMPK激活剂，黄连已被报道可以增加肝细胞系L02的SIRT1的表达水平，在氧化应激中，SIRT1可以诱导FOXOs转录因子去乙酰化，发挥抗氧化、调节代谢和细胞增殖的作用。黄连可能通过AMPK诱导的SIRT1/FOXO途径增加应激调节基因SOD表达，发挥抗衰老及延年益寿的功效[49];NF-κB信号通路的激活，其特征是促炎性细胞因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）的循环水平升高，许多研究表明，AMPK激活下调了各种细胞中的NF-κB激活。其中NF-κB激活，最终将导致诸如AD、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、动脉粥样硬化等与衰老相关的慢性炎性疾病的发生率增加。小檗碱通过发挥抗炎作用调节衰老相关性疾病可能涉及AMPK抑制了NF-κB依赖性途径[50]。

综上所述，川产道地药材黄连及其提取物抗衰老及衰老相关性疾病作用确切，相关通路机制较为复杂，仍未得到充分阐明。但上述这些证据支持了黄连及其提取物，特别是小檗碱是非常有前景的抗衰老天然产物，并具有成为对抗衰老相关疾病的药物潜力。我们发现黄连的多种药理作用是由于其对多个靶标和途径的整体网络作用，但是哪些成分调节靶标以及这些成分之间是否存在协同/拮抗作用等，有待进一步研究。雅连作为川产道地药材，如何整合黄连的有效成分，在抗衰老、皮肤保护、治疗衰老相关性疾病等领域明确其药理作用和靶点，将对川产道地中药材现代研究及应用有重要意义。

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（2020-01-09收稿 責任编辑：王明）