FABP5-PPARγ信号通路对血管性痴呆大鼠学习记忆及脂质代谢的影响*

陈丹丹， 董 莹， 杨晓丹

((1. 天津中医药大学第一附属医院脑血管病科， 天津 300300； 2. 吉林省肿瘤医院放疗三科， 长春 130012； 3. 中国人民解放军第九八三医院神经内科， 天津 300142)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由脑血管疾病引起的认知功能和智能障碍综合征,是老年痴呆一种常见的病因之一[1]。VD的发病率逐年升高，并趋于年轻化，已经成为继阿尔茨海默病的第二大痴呆类型。VD的主要临床症状表现为学习记忆及认知功能的下降，且阶梯式加重，进而影响患者的日常生活及社会活动[2]。但VD的发病机制尚未完全阐明，目前其分子机制主要集中在胆碱能系统、突触可塑性变化、氧化应激、tau蛋白磷酸化、炎症反应等。有研究提出，脂质代谢异常与认知功能障碍有着密切的关系[3]，且在VD患者脑内出现脂质代谢异常的情况。脂肪酸结合蛋白5(fatty acid binding protein 5, FABP5)参与脂肪酸的摄取、结合、转运和代谢。在AD模型鼠脑内FABP5表达减少，其通过降低花生四烯酸乙醇胺调节认知功能，与学习记忆有关[4]，但其在VD中的作用鲜有报道。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是核激素受体家族中的配体激活受体，参与脂肪、葡萄糖和能量代谢的协调[5]，是控制脂肪因子基因表达的关键转录因子，PPARγ在VD模型中表达降低。在前列腺癌中FABP5可通过FABP5-PPARγ-VEGF信号通路转运过量的脂肪酸，从而增加血管的生成、加快前列腺癌的恶性进展[6]。

本实验旨在研究FABP5在VD模型中的作用，检测FABP5及其下游分子表达的变化，以探讨FABP5-PPARγ信号通路对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及脂质代谢的影响，为在临床上有效治疗VD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠，体重220～250 g，50只，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，于SPF级饲养。SB-FI-26购自美国APEXBIO公司，FABP5及LPL一抗购自ABCAM公司，PPARγ及p- PPARγ一抗购自美国Cell signaling公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物公司，ECL发光液购自武汉博士德生物公司，二抗购自北京中杉金桥生物技术公司，Trizol及RT-qPCR试剂盒购自天津鼎国生物技术有限责任公司。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)试剂盒购自中生北控生物科技福分有限公司；游离脂肪酸(FFA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物分组及模型制备

(1)将30只SD大鼠随机分为三组：正常对照组(WT组)、假手术组(sham组)和VD模型组(VD组)，每组10只。VD模型采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备；假手术组大鼠仅分离颈总动脉但不结扎。术后使用104U庆大霉素3 d以预防感染。WT组不做任何处理。(2)将20只SD大鼠随机分为2组(n=10)：WT组和鼻腔给予FABP5抑制剂SB-FI-26组。给药组每日鼻腔给予1 mg/kg的FABP5抑制剂SB-FI-26溶液，WT组大鼠每日鼻腔给予同等体积的生理盐水,给药4周，以探讨FABP5是否通过调控PPARγ来发挥其在VD中的作用。

1.3 Morris水迷宫实验

实验造模或鼻腔给药4周后行Morris水迷宫实验。(1)定位航行实验：将平台放置于水迷宫第三象限的中央，每天将大鼠头朝壁侧从相邻象限放入水中，记录大鼠找到并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期。实验时间为120 s，若大鼠在120 s内未找到平台，则将其引至平台停留20 s，逃避潜伏期记为120 s。每天训练2次，两次间隔时间为20 min。定位航行实验历时5 d。(2)空间探索实验：在实验第6日撤去平台，在第一象限将大鼠头朝壁侧放入水中，每只大鼠游泳1次，历时120 s。记录大鼠跨越隐匿平台的次数及入水朝向角。

1.4 脑组织样本的制备

Morris水迷宫实验结束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)经左心尖灌注至肝脏变白，断头取脑。一侧分离皮质和海马放入-80℃冰箱备用；一侧分离大脑，称取适量脑组织，匀浆，4℃下用正庚烷和异丙醇 (2∶3.5, v/v) 抽提脂质，3 000 r/min低温冷冻离心10 min，取上清存于-80℃备用。

1.5 RT-qPCR检测FABP5、PPARγ和LPL在大脑海马及皮层的转录水平

用Trizol试剂盒，按照说明书提取大鼠皮层及海马组织的总RNA，在7500 Real-Time qPCR 仪(美国Applied Biosystems)上进行实时定量PCR反应。以GAPDH基因为内参，根据目的基因与内参基因的Ct值求得目的基因的相对表达量。

1.6 Western blot检测FABP5、PPARγ、pPPARγ和LPL在大脑海马及皮层的蛋白表达水平

取出大鼠海马和皮层组织，根据组织质量加入适量蛋白裂解液于冰上进行匀浆，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度并调成等浓度；煮沸变性3 min，制胶、上样、电泳、转膜、封闭，然后稀释一定比例的一抗孵育(FABP5 1∶800，PPARγ 1∶5 000，pPPARγ 1∶1 000，LPL 1∶800)4℃摇床过夜，加入稀释二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，PBS冲洗，加入ECL发光液于化学发光仪检测拍照。采用Image J图像处理软件分析条带的光密度(OD)值。

1.7 生化检测脑组织TG、TC和FFA含量

取制备好的脑组织上清液，按照试剂盒说明书测定各组脑组织中的TC、TG和FFA含量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 3组大鼠学习记忆能力的比较

2.1.1 3组大鼠学习记忆能力的比较 定位航行实验结果显示，从第2日开始 VD组大鼠的逃避潜伏期较WT组和sham组延长，且随着进一步的训练，VD组大鼠的逃避潜伏期与WT组和sham组的差异更加显著，WT组和sham间无显著性差异(表1)。空间探索实验结果显示，与WT组和sham组相比，VD模型大鼠跨越隐匿平台的次数明显减少、入水朝向角显著增大(表2)。Morris水迷宫结果显示，VD大鼠的学习记忆能力受损。

Tab. 1 The escape latency in navigation test among three groups of rats (s, n=10)

Tab. 2 The number of cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment among three groups of rats n=10)

2.1.2 使用抑制剂后2组大鼠的学习记忆能力的比较 与WT组大鼠相比，SB-FI-26给药组大鼠的逃避潜伏期延长(表3)；跨越隐匿平台的次数明显减少，入水朝向角增大(表4)。因此当鼻腔给予SB-FI-26后，FABP5受到抑制，从而使得大鼠的学习记忆能力降低。

Tab. 3 The escape latency in navigation testbetween two groups of rats (s, n=10)

Tab. 4 The number of cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment between two groups of rats n=10)

2.2 3组大鼠FABP5、PPARγ和LPL在大鼠海马和皮层中的转录水平的比较

与WT组和sham组相比，VD组大鼠海马及皮层FABP5、PPARγ和LPL的转录水平显著降低，WT及sham组无显著性差异(表5)。

与WT组相比，SB-FI-26给药组大鼠海马及皮层中的PPARγ和LPL的转录水平明显降低(表6)，表明SB-FI-26通过抑制FABP5可抑制PPARγ和LPL的转录。

Tab. 5 Expressions of FABP5, PPARγ and LPL in each group by RT-qPCR n=10)

Tab. 6 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway in WT rats by RT-qPCR n=10)

2.3 3组间FABP5-PPARγ通路相关蛋白在大鼠脑内表达水平的比较

与WT组和sham组相比，VD组大鼠大脑皮层及海马FABP5表达明显减少；总PPARγ在皮层中的表达降低，在海马中的表达降低更显著；pPPARγ在皮层中的表达显著减少，在海马中的表达降低更显著；LPL在海马中的表达减少，其在皮层中的表达降低更为显著(表7，图1)。

和WT组比较，SB-FI-26给药组大鼠大脑皮层和海马中FABP5、总PPARγ、pPPARγ及LPL蛋白的表达显著降低(表8，图2)。

Tab. 7 Relative expressions of FABP5, PPARγ, p-PPARγ and LPL protein inhippocampus and cortex n=10)

Fig. 1 Expressions of FABP5, PPARγ, p-PPARγ and LPL protein in hippocampus and cortex

Tab. 8 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway by Western n=10)

*P<0.05,**P<0.01 vs WT group

2.4 3组大鼠脑组织脂代谢的比较

如表9所示，VD组大鼠脑内TC、TG和FFA含量均显著高于WT组，sham组和WT组无显著差异，结果表明VD大鼠脑内出现脂代谢异常。

Fig. 2 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway by Western blot

Tab. 9 Comparison of TC, TG and FFA levels in the brain of each group (mmol/L, n=10)

如表10所示，与WT组相比，SB-FI-26给药组大鼠脑内的TC、TG和FFA含量明显升高，正常大鼠FABP5被抑制后同样出现脂质代谢异常情况，因此推测FABP5介导大鼠脑内脂质代谢。

Tab. 10 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on TC, TG and FFA levels in the brain of WT rats(mmol/L, n=10)

3 讨论

血管性痴呆(VD)是一种由脑血管异常引起的认知功能下降的进行性神经退行性疾病，是老年痴呆的主要类型之一，其具体病因尚不完全明确。在中枢神经系统中，脂质参与细胞结构的构建、物质的转运，神经元信号的传递及突触的发育等，有助于维持神经细胞的正常生理功能。因此，大脑中脂质代谢异常部分反映脑功能障碍。诸多研究发现，很多脑部的疾病均出现脑内脂蛋白代谢的异常，如阿尔茨海默症、亨廷顿氏舞蹈症(HD)、尼曼匹克病(NPC)、中风及精神分裂症等[7, 8]，同样在VD发生发展过程中，体内也出现脂代谢异常，血脂过高可沉积于血管壁上，造成血管粥样硬化，还可造成血氧降低，进而损害学习记忆能力，因此脂代谢异常也是VD发生的危险因素之一[9]。

脂肪酸结合蛋白5(FABP5)是一种15 KDa的胞质蛋白，属于FABP家族，有研究揭示，FABP在大脑发育中有多种作用，包括神经元和神经胶质细胞的生成、分化、神经元细胞迁移，并且它还参与脂肪酸(FAs)的摄取、结合、转运和代谢[10]。FABP5与前列腺癌、膀胱癌、胰腺、乳腺癌和胶质母细胞瘤等恶性肿瘤有关，FABP5除了和肿瘤相关，还和学习记忆有关。Pan Y等研究指出，敲除FABP5后，减少外源性二十二碳六烯酸(DHA)进入脑内皮层细胞和脑毛细血管的吸收，降低脑实质内源性DHA水平，小鼠表现出认知缺陷[11]，本研究结果显示，VD模型大鼠脑内FABP5表达显著减少，大鼠的学习记忆能力明显下降，正常WT大鼠脑内的FABP5被抑制后，学习记忆能力也显著降低。因此推测FABP5的异常表达和学习记忆能力有关。FABP5转运的过量脂肪酸可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达和血管生成[6]。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor ，PPAR)是配体激活的转录因子，属于核受体超家族，以α，β/δ和γ三种同种型存在。PPAR-γ存在于血管细胞上，在血管内皮功能障碍中发挥保护作用[12]。PPAR-γ及其受体还广泛分布于中枢神经系统。这些受体的激活可通过减少氧化应激[13]和炎性机制来防止神经元死亡[14]，在神经保护调节中起着重要的作用。PPAR-γ激动剂吡格列酮和罗格列酮可以减弱链脲佐菌素(STZ)对大鼠学习和记忆的影响，减弱STZ诱导的内皮细胞功能障碍[15]。最近报道指出，PPAR-γ参与AD的记忆和认知功能的改善[16]。PPARγ是影响脂质代谢的重要转录因子。在巨噬细胞内PPARγ介导脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)的表达。PPARγ结合视黄酸受体(RXR)以形成PPAR-RXR的结构， PPAR-RXR可被脂肪酸和LPL脂质分解激活，从而引发脂质积聚过程[17]。此外，据报道 在LPL基因的启动子位点存在过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PPRE)，可以调节细胞中LPL的表达[18]。 体内外的研究表明，PPARγ可启动表达将前体细胞转化为成熟脂肪细胞所需的基因，是脂肪生成所必须的调节剂。

脂蛋白脂肪酶(LPL)是脂肪酶基因家族的一员，可以水解脂蛋白中的甘油三酯，参与调解脂肪酸代谢，促进细胞对脂蛋白、脂质和脂溶性维生素的吸收，是影响血脂水平的重要脂质代谢酶[19]。LPL主要分布在脂肪和肌肉组织中，其在大脑中也高表达。然而，目前对LPL在大脑中的作用知之甚少，仍在研究之中。大脑神经元对脂蛋白的吸收与突触结构和功能的完整性有关，因此LPL促进脂蛋白在脑内的吸收有着重要的作用。有研究表明，LPL可以与载脂蛋白E及其受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)结合，并出现在AD模型的老年斑中。在星形胶质细胞中，LPL可以结合β淀粉样蛋白(Aβ)，并促进Aβ的吸收及清除[20]。这些结果都提示LPL在大脑中具有重要的生理作用，其改变可能和大脑的学习记忆损伤有关。

综上，本研究结果表明， VD模型大鼠学习记忆能力降低，脑内出现脂质代谢紊乱，FABP5、PPARγ、p-PPARγ及LPL在转录水平及蛋白水平上均显著降低；当对WT鼠给予FABP5抑制剂处理后，WT大鼠的学习记忆能力显著降低，FABP5、PPARγ、p-PPARγ及LPL的表达也明显减少，提示FABP5可能通过FABP5- PPARγ-LPL影响大鼠脑内的脂质代谢，进而影响其学习记忆能力。