甘麦大枣汤对抑郁模型大鼠海马神经元突触结构及结构蛋白表达的影响*

郭 锐， 秦卫帅， 张双勇， 张淑玲

((1. 郑州市中医院脑病一科， 河南 郑州 450007； 2. 郑州市人民医院神经内科， 河南 郑州 450003)

抑郁症是以情绪低落、快感缺失、行为迟缓等为主要特征的精神性疾病，重度抑郁症患者会有明显的自杀念头及行为，严重威胁人类身心健康。目前，全球大约有9亿人口患有不同程度的抑郁症，且发病率逐年升高，预测到2020年，将上升为世界第二大疾病[1]。目前，抑郁症的确切发病机制不明，但存在一些较为公认的假说，包括神经递质假说、细胞因子假说、神经营养假说等[2]。越来越多的研究证明，神经突触可塑性改变在抑郁症的形成过程中作用关键，抑郁状态下，往往伴随着神经元凋亡及突触可塑性下降等病理改变，海马则是其主要靶部位[3-4]。甘麦大枣汤出自汉代张仲景《金匮要略》，具有养心安神、和中缓急功效，主要用于改善睡眠，近年来其抗抑郁功效逐渐被重视，临床常使用甘麦大枣汤及其加减方治疗各类抑郁症，疗效明显[5-6]。为了更好的明确甘麦大枣汤的抗抑郁功效及其机制，为临床应用提供实验依据，本研究在建立抑郁动物模型的基础上，以观察神经突触结构及结构蛋白MAP-2和GAP-43表达为切入点，评价甘麦大枣汤抗抑郁的疗效及探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只，雄性，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证：SCXK(京)2016-0011。大鼠购入后先适应性喂养3 d，实验期间大鼠均在室温(25±1)℃、相对湿度(50±5)%环境下喂养。

1.2 药物

甘麦大枣汤由炙甘草9 g、小麦30 g、大枣5粒组成，中药原药材均购自郑州市中医院，全方共煎煮2次，第一次加入10倍量水，第二次加入8倍量水，合并两次水煎液，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，打粉称重后保存备用。根据人临床用量折算出大鼠等效剂量，高、低剂量分别为等效剂量的2倍、1倍，分别含生药量9.72、4.86 g/kg；氟西汀购自礼来苏州制药有限公司，批号为0925A，给药剂量为10.8 mg/kg。

1.3 试剂与仪器

5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)试剂盒购自武汉伊莱瑞特公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Thermo公司；核酸蛋白定量仪购自英国BioDrop公司；兔抗大鼠MAP-2、GAP-43、GAPDH多克隆抗体购自美国CST公司，HPR标记的山羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；组织切片机购自美国WPI公司；显微镜购自德国Zeiss公司。

1.4 动物分组与造模

大鼠适应性喂养3 d后，根据体质量将其随机分为5组，包括正常对照组，抑郁模型组，氟西汀组，甘麦大枣汤高、低剂量组，每组12只。除正常对照组外，其余各组大鼠均给予21 d慢性不可预见性温和应激(CUMS)，应激因素包括24 h禁食禁水、24 h昼夜颠倒、4 min 50 V电击、1 min夹尾、4 h 80 db噪音、5 min 50℃热水浴、5 min 4℃冰水浴，每天随机采用1次，同一种应激不连续出现，应激造模期间动物均孤笼饲养。

1.5 动物给药

于应激造模同时灌胃给药，氟西汀组给予阳性对照药氟西汀，剂量为10.8 mg/kg，甘麦大枣汤高、低剂量组分别给予复方中药甘麦大枣汤9.72、4.86 g/kg，对照组与模型组则给予等体积的蒸馏水，给药体积为10 ml/kg，每日1次，连续21 d。末次给药完成后，所有大鼠进行行为学检测，检测完成后麻醉，部分大鼠取脑组织固定于多聚甲醛中，另一部分大鼠剥离海马组织冷冻保存。

1.6 行为学检测

1.6.1 糖水消耗实验 于测试前12 h对大鼠禁水不禁食，每只大鼠给予两个水瓶，水瓶摆放位置随机，一瓶装1%蔗糖水，另一瓶装蒸馏水，记录大鼠6 h内分别摄入蔗糖水和蒸馏水的体积，计算糖水偏好度=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+蒸馏水消耗量)×100%。

1.6.2 旷场测试 于测试前1 h将待测大鼠放入测试房间适应环境，测试开始后，关闭房间灯光，将大鼠置于底面有25个小方格的黑色敞箱中，待其自由活动1 min后，记录大鼠4 min内水平运动格数以及垂直竖立次数，计算两者之和作为自主活动评分。

1.7 ELISA法检测单胺递质5-HT、NE含量

取冷冻保存的海马组织，称重，按10 μl/mg组织加入预冷的PBS液，冰上匀浆后离心，取上清液，加入到预先包被5-HT、NE抗体的试剂盒中，按照试剂盒说明书进行操作，于酶标仪450 nm波长下测定光密度值，根据标准曲线计算海马组织中单胺递质的含量。

1.8 Golgi染色观察海马神经元突触形态

取脑组织切成小块，浸泡于媒染液中，避光放置3 d；然后置于1.5%硝酸银水溶液中浸泡镀银，置暗处放置3 d，每天定时更换新银液，充分镀银后，切片，漂洗，脱水，树胶二甲苯封片，晾干后置于显微镜下观察神经元突触形态。

1.9 免疫组化法检测海马MAP-2、GAP-43阳性表达

取固定完全的脑组织，脱水，包埋，切片，室温下脱蜡，水化，进行热抗原修复；滴加山羊血清封闭液封闭非特异性位点，除去封闭液，滴加一抗孵育过夜；洗涤，滴加二抗室温下孵育25 min，洗涤，滴加DAB染液，染色合适即终止，苏木素复染，脱水，滴加适量中性树胶封片，晾干片子后于显微镜下拍照。使用Image-pro Plus软件分析海马MAP-2、GAP-43积分光密度值(IOD值)。

1.10 Western blot法检测MAP-2、GAP-43蛋白相对表达量

取冷冻保存的海马组织，加入RIPA裂解液充分裂解后匀浆，离心后取上清液，测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，凝胶电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后的兔抗大鼠多克隆一抗(MAP-2，1∶1 000；GAP-43，1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4℃孵育过夜。次日用TBST液洗涤条带3次，每次15 min，加入山羊抗兔单克隆二抗(1∶500)室温下孵育4 h，TBST液洗3次，每次15 min，之后进行ECL显影。应用Image J软件分析条带灰度值，根据目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值计算蛋白相对表达水平。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 甘麦大枣汤对行为学的影响

与对照组比较，抑郁模型组大鼠糖水偏好度与自主活动能力均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，给予氟西汀或高剂量甘麦大枣汤干预后，大鼠对糖水的喜好度及自主活动水平均显著回升(P< 0.01)。此外，低剂量甘麦大枣汤也能改善模型大鼠的自主活动评分(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of Ganmai Dazao Tang on the behavioral changes in depressive rats n=12)

2.2 甘麦大枣汤对海马单胺递质含量的影响

与对照组比较，抑郁模型大鼠海马单胺递质5-HT、NE含量均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀和高剂量甘麦大枣汤组大鼠海马5-HT、NE含量均显著升高(P<0.05或P<0.01)，低剂量甘麦大枣汤对大鼠单胺递质含量无明显影响(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Effects of Ganmai Dazao Tang on the monoamine neurotransmitters in depressive rats (ng/g, n=6)

2.3 甘麦大枣汤对海马神经元突触结构的影响

正常大鼠海马神经元丰富，树突棘分枝较长且均一，排列整齐致密；与对照组比较，模型组大鼠海马神经元排列散乱，树突棘萎缩，分枝变短，稀疏无规则，突触损伤明显；与模型组比较，氟西汀和高剂量甘麦大枣汤组大鼠神经元突触损伤明显减轻，树突棘的复杂性和可塑性得到恢复，低剂量甘麦大枣汤组树突棘的长度与数量有一定增加，但效果不如高剂量组明显(图1)。

Fig. 1 Effects of Ganmai Dazao Tang on synaptic morphology of hippocampal neurons in depressive rats (×200)

2.4 甘麦大枣汤对海马突触结构蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠海马突触结构蛋白MAP-2和GAP-43表达均显著下调(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀和高剂量甘麦大枣汤组大鼠突触结构蛋白的表达均显著上调(P<0.05或P<0.01)，低剂量甘麦大枣汤组仅MAP-2的表达显著上调(P<0.05，图2，3，表3)。

Fig. 2 Hippocampal MAP-2 and GAP-43 immunohistochemical staining(×200)

Fig. 3 Hippocampal MAP-2 and GAP-43 Western blot

Tab. 3 Effects of Ganmai Dazao Tang on the expressions of MAP-2 and GAP-43 in depressive rats n=4)

3 讨论

持续的不可预见性应激是导致抑郁症发生的关键原因，依据此特点创建的CUMS模型已被广泛使用于国内外的抑郁症相关研究中。在本研究中，CUMS造模21 d后，行为学检测发现模型大鼠蔗糖水偏好度及自主活动能力均明显下降，符合抑郁症患者的临床特征，提示抑郁模型建立成功。

海马是调控学习与记忆功能的关键脑区，其病理生理情况决定了抑郁症的发生发展。临床和基础研究均证实，在抑郁状态下，大脑海马存在体积变小、萎缩、神经元缺失等病理损伤现象[7-8]。5-HT是导致抑郁症发生最为关键的一种单胺神经递质，目前临床抑郁症一线用药，如氟西汀、帕罗西汀、西酞普兰等均是通过选择性地抑制脑内5-HT的再摄取，增加神经元间5-HT含量，从而保证神经元信号的正常传导，发挥抗抑郁功效[9-10]。本研究发现，甘麦大枣汤不仅能显著改善模型大鼠的抑郁样行为，还能升高海马单胺递质的含量，表明其有良好的抗抑郁效果，与文献报道一致[11]。

突触是神经元间信息传递的基础，神经元通过突触互相联系，从而形成一个复杂的大脑信息处理网络[12-13]。多种神经性疾病的发生均会出现突触形态、密度异常、骨架蛋白缺失等病理特征[14]。MAP-2是一种微管相关蛋白，主要表达于神经元树突和突触后致密区，是神经元树突静态结构蛋白。MAP-2参与神经元生长、突起形成和突触可塑性调节等，维持突触结构与功能，对中枢神经系统内神经元间的正常信号传递起着关键调节作用[15]。GAP-43是一种分子量为43 kD的神经调节素，主要分布在突触前膜，与神经元生长发育、轴突生长及再生以及突触重塑等关系密切。研究报道，参与学习记忆的海马长时程增强(LTP)的强度及持续时间与脑内GAP-43表达水平有关[16-17]。本研究中，抑郁模型大鼠海马MAP-2和GAP-43表达下降，这可能与Golgi染色显示的神经元突触损伤有关，而在氟西汀或者甘麦大枣汤治疗后，模型大鼠突触损伤得以改善，树突棘长度、密度及分枝等明显增加，同时海马MAP-2和GAP-43表达回升。

本实验以海马为关键靶区研究甘麦大枣汤的抗抑郁功效及机制，发现甘麦大枣汤能有效改善抑郁模型大鼠的快感缺失、运动不能等抑郁特征，升高海马单胺递质含量，其作用可能与调控突触结构蛋白MAP-2和GAP-43的表达而保护神经元突触有关。本研究从突触结构探讨了甘麦大枣汤的抗抑郁机制，为其临床应用提供了更多的实验依据，下一步拟从突触功能进行相关研究。