利格列汀对小鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用*

赵 波， 魏海萍

((1. 甘肃省平凉市第二人民医院神经内科, 平凉 744000; 2. 兰州大学第二医院神经内科， 兰州 730030)

脑卒中是世界范围内导致残疾的主要原因之一。治疗缺血性脑卒中关键策略是快速恢复脑血流，但是在血液再灌注期间通常发生组织损伤加重，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。因此，有效预防和控制I/R损伤具有重要临床意义。利格列汀是二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制剂，是一种治疗2型糖尿病药物。利格列汀可改善胰岛素抵抗大鼠脑胰岛素敏感性和认知功能障碍[1]。除了降糖作用以外，利格列汀对葡萄糖诱导神经退行性病变线虫模型具有保护作用[2]。此外，利格列汀对动物心脏I/R损伤模型也具有保护作用[3]。根据上述研究推测，利格列汀也可能在动物脑I/R损伤模型中发挥神经保护作用。因此，本研究目的是评估利格列汀在小鼠脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)诱导I/R损伤模型中的神经保护作用，并对其机制进行进探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性BALB/c小鼠(22～28 g)，购于甘肃医学院动物中心。室温下自由饮食和饮水。将BALB/c小鼠随机分成：Sham组、I/R组、利格列汀(2.5 mg/kg)+I/R组、利格列汀(5 mg/kg)+I/R组和利格列汀(10 mg/kg)+I/R组，每组均为8只小鼠。不同剂量利格列汀组小鼠均在I/R前3周连续灌胃给药，剂量分别为2.5、5和10 mg/kg。

1.2 实验仪器和试剂

光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；利格列汀(日本朝日化学公司)；TTC染料(美国Sigma公司)；谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；PI3K、AKT和mTOR ELISA试剂盒(上海内含子生物科技有限公司)。

1.3 MCAO诱导小鼠脑I/R模型

腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.06 g/kg)麻醉小鼠，剪毛后进行颈部手术。在显微镜下分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，对颈总动脉近心端和颈外动脉远心端结扎，用针在颈外动脉远端动脉壁上扎一个小口，将线栓从颈外动脉小孔插入颈总动脉，通过颈内动脉到达大脑中动脉，固定线栓，MCAO后1 h 拔出线栓，缝合皮肤，再灌注24 h评估神经功能缺损(n=8)和及梗死体积(n=4)；再灌注48 h检测脑组织中GSH、MDA、PI3K、p-Akt和mTOR含量(n=4)。模型成功的标志是小鼠麻醉清醒后出现手术侧肢体瘫痪，站立不稳，小鼠可存活1周。I /R 手术成功率约为70%。Sham 组小鼠只进行相关手术步骤，但不插入线栓。

1.4 小鼠神经功能缺损评估

小鼠再灌注24 h，按照改良Beordson’s法[4]进行神经行为学评分。0分为正常行走，无神经功能缺损；1分为提尾悬空时，手术对侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋及肘外展；2分为将小鼠置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低；3分为小鼠置于光滑平面上，围绕手术对侧转圈者；4分为不能行走，意识丧失。评分越高，神经损伤越严重。

1.5 小鼠运动协调性评估

各组小鼠评估前3 d进行连续适应，小鼠再灌注24 h后，通过旋转杆试验测定各组小鼠的运动协调能力[5]。把小鼠被放置在直径3 cm防滑杆上，杆以10 r/min速度旋转，记录小鼠从杆上跌下时间。

1.6 小鼠大脑梗死体积的检测

小鼠再灌注24 h，大脑行冠状切片，厚度为2 mm。然后将脑片放入1% TTC磷酸盐缓冲液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。脑梗死区域不染色(灰白色)，而正常脑组织染为深红色。依据相关研究[6]方法计算I/R后脑梗死体积。

1.7 小鼠脑组织MDA和GSH含量的检测

小鼠再灌注48 h，将小鼠迅速断头取脑，放入 -80℃冰箱保存。脑组织在10%冰冷磷酸盐缓冲液中匀浆，然后离心(4 000 r/min)取上清液。按照检测试剂盒步骤检测脑组织中MDA和GSH含量。

1.8 小鼠脑组织PI3K、P-Akt和TOR水平的ELISA检测

脑组织在10%冰冷磷酸盐缓冲液中匀浆，然后离心(4 000 r/min)取上清液，按照ELISA试剂盒规定的步骤检测脑组织中磷酸化肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase, PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphoryated of protein kinase B, P-Akt)的活性和雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycinm,TOR)的含量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 利格列汀对运动协调影响

如表1所示，不同组小鼠基线下跌落时间无统计学差异。与Sham组相比，I/R组小鼠跌落时间显著降低(P<0.05)。与I/R组相比，不同剂量利格列汀均可显著延长缺血后跌落时间 (P<0.05)。

Tab. 1 The effect of linagliptin on motor coordination of mice in each group (s, n=8)

2.2 利格列汀对神经功能缺损影响

各组小鼠再灌注24 h，进行神经行为学评分。Sham组小鼠无神经功能缺损；与Sham组相比，I/R组小鼠神经功能评分显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与I/R组相比，不同剂量利格列汀均可显著降低小鼠神经功能评分 (P<0.05，表2)。

各组小鼠再灌注24 h，进行TTC染色。如图1所示，Sham组小鼠无脑梗死；与Sham组相比，I/R组小鼠脑梗死体积显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与I/R组相比，不同剂量利格列汀均可显著降低小鼠脑梗死体积(P<0.05，表2，图1见彩图页Ⅳ)。

Tab. 2 The effect of linagliptin on the neurobehavioral score and infarct volume of mice in each group n = 8)

2.3 利格列汀对脑组织生化指标影响

如表3所示，Sham组相比，I/R组小鼠脑组织MDA含量显著增加(P<0.05)；利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可显著降低I/R小鼠脑组织MDA含量(P<0.05)。Sham组相比，I/R组小鼠脑组织GSH含量显著降低(P<0.05)；利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可显著提高I/R小鼠脑组织GSH含量(P<0.05)。如表4所示，Sham组相比，I/R组小鼠脑组织PI3K、P- Akt和mTOR含量显著降低(P<0.05)。而利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)可显著提高I/R小鼠脑组织PI3K、P-Akt和mTOR含量，并呈剂量依赖性(P<0.05)。

Tab. 3 The effects of linagliptin on MDA and GSH content in brain of mice in each group n=4)

Tab. 4 The effects of linagliptin on the contents of PI3K, pAkt and mTOR in the brain of mice in each group n = 4)

3 讨论

这项研究为口服利格列汀(2.5、5和10 mg/kg)在I/R小鼠中的神经保护作用提供了新的证据。这是首次通过神经功能缺损评分、行为改变、脑梗死体积变化、氧化应激和PI3K/PAKT/mTOR通路证实利格列汀在小鼠I/R模型中神经保护作用。在本研究中，各组小鼠在缺血前、后体重及血糖变化无统计学差异，提示小鼠生理功能相对稳定。这一发现排除了其他因素对利格列汀在MCAO小鼠中发挥神经保护作用的影响。结果也提示利格列汀对血糖水平影响主要取决于糖尿病状态。先前研究表明，维达列汀对非糖尿病大鼠体重与代谢指标变化无影响[7]。这与本研究是一致的。MCAO诱导小鼠I/R模型导致神经功能缺损评分增高及运动协调性降低。本研究与先前研究一并反映出I/R动物可出现严重的神经和运动功能障碍[8]。利格列汀预处理21d可显著减少I/R小鼠神经功能缺损评分，并改善I/R小鼠动物协调性。以往研究表明，DPP-4抑制剂维格列汀对鱼藤酮帕金森病大鼠具有神经保护作用，并可改善运动协调性[9]。

众所周知，缺血性脑卒中在缺血过程中产生氧化应激，导致缺血性脑组织DNA受到损伤[10]。本研究结果显示，I/R小鼠脑组织中MDA(脂质过氧化终产物)含量增高，而GSH(内源性抗氧化酶)含量减少。这意味着氧化应激参与I/R小鼠神经功能障碍。利格列汀预处理后，I/R小鼠脑组织中MDA降低，GSH含量增加，表明利格列汀抗氧化活性参与了I/R小鼠神经保护作用。PI3K/AKT通路是一种公认介导细胞内代谢、增殖、炎症、生长和存活的途径。激活PI3K导致p-Akt上调，其是神经元存活和生长关键因素[11]。同样，mTOR是PI3K/AKT通路下游的重要成员，可调节蛋白质合成、神经元再生、生长、存活、血管生成和突触可塑性[12]。在本研究中，I/R小鼠脑组织中PI3K、p-Akt和mTOR含量显著减少。这一发现与以前研究是一致的。Li等人研究显示，脑缺血导致PI3K/AKT/mTOR通路失活，随后引起神经元缺失及神经功能障碍[13]。有研究报道，氧自由基升高可抑制Akt磷酸化和mTOR活化[14]。因此，在本研究表明，氧化应激升高可能导致I/R小鼠PI3K/AKT/mTOR通路失活。利格列汀预处理I/R小鼠脑组织再PI3K、p-AKT和mTOR含量显著增高。这表明利格列汀对I/R小鼠神经保护作用通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，可能是通过该通路的抗氧化活性。以往研究指出，利格列汀可通过激活p-AKT/PKB途径减少肥胖糖尿病大鼠的脑梗死体积[15]。

本研究表明，利格列汀可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，改善神经功能缺损，减少梗死体积，对MCAO小鼠具有神经保护作用。进一步研究需要明确利格列汀发挥神经保护作用的确切分子机制。