脂肪因子Vaspin在运动与甲鱼油对老年肥胖大鼠胰岛素抵抗的作用*

孙 林， 柏友萍， 林伟其

((安徽师范大学体育学院， 芜湖 241003)

随着社会经济的高速发展，人们的物质条件不断改善，超重、肥胖现象在全世界加速流行[1]。研究发现，我国老年肥胖人口数量逐年攀升，直至2014年我国老年人群的超重、肥胖率已经达到了41.6%、13.9%[2]。这意味着我国将有越来越多的老年人群面临肥胖相关疾病的威胁。Vaspin是近年来新发现的一种脂肪因子，现有的研究认为Vaspin与肥胖、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、糖尿病、高血压以及心血管疾病有关[3-4]。

运动是一种便捷有效的减肥方式，而甲鱼油作为一种补品，其富含微量元素和多不饱和脂肪酸。目前有关运动与甲鱼油对Vaspin mRNA表达、蛋白表达、血浆Vaspin浓度、血糖以及IR的影响尚不清楚。基于此，本实验通过建立老年肥胖SD大鼠实验动物模型，制定运动与补充甲鱼油方案，探讨运动与甲鱼油对老年肥胖大鼠内脏脂肪组织Vaspin水平及IR的影响，为了解老年肥胖及进一步预防肥胖相关疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

本次实验大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证号：2007000546402，许可证号：SCXK(沪)2012-0002)，实验通过了安徽师范大学动物伦理学会同意(20150225)，符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

选取鼠龄3周的雄性SD大鼠(n=50)，清洁级。喂普通饲料至大鼠周龄为55周，普通饲料营养素比例为脂肪 6.0%、蛋白质26.4%、碳水化合物67.6%。大鼠在20℃±2℃，相对湿度50%～70%的环境下分笼饲养，自由饮食饮水。采用体重无差异原则(P>0.05)分为对照组与肥胖建模组，对照组为12只喂普通饲料，肥胖建模组38只喂高脂饲料(高脂饲料营养素比例为脂肪40.0%，蛋白质40.0%，碳水化合物20.0%)。建模5周后，符合老年肥胖标准(60周龄，肥胖大鼠体重>120%对照组)为建模成功。随机选取建模成功的老年肥胖大鼠24只分为4组(n=6)：肥胖模型组(OA)、运动组(OB)、单纯补充甲鱼油组(OF)、运动结合甲鱼油组(OBF)。在干预过程中OA、OF组各死亡1只大鼠。

1.2 主要试剂

大鼠的Vaspin ELISA试剂盒(美国TSZ 公司生产，上海研域生物科技有限公司代理)。血糖试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)。M-MLV 反转录酶(Promega，M1705)，R Nase Inhibitor(Sun Shine Bio TM，Trizol(Sun Shine Bio TM，SN114)，Go Taq q PCR Master Mix(Promega，A6002)，R0004)，Oligo d T15(Sun Shine Bio TM)，Random prime(Sun Shine Bio TM)，100 bp DNA Ladder(Sun Shine Bio TM，SN124)；6 × SDS protein Loading buffer(还原型，Sun Shine BioTM，SN336)，PVDF膜(Millipore)，大鼠抗 β-actin 抗体(Boster，BM0627)，羊抗小鼠 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine BioTM，SN135)，羊抗兔 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine Bio TM，SN134)，兔抗Vaspin 抗体(Bioss，bs-6182R)，TBST(含 0.05%Tween20的TBS 缓冲液)，X光胶片(柯达)，Supersignal West Pico Trial kit(Pierce，34079)显影液、定影液(Sunshinebio，SN340)。

1.3 主要仪器

6跑道大鼠跑台(Wi32812 /北京)；酶标仪(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板机(Tecan Co-lumbus Washer / 瑞士)；全自动生化分析仪(日立 7060)；PCR仪(MJ research，PTC200)，高速冷冻离心机(力康生科，Neofuge15R)，台式高速离心机(eppen-dorf，Centrifuge5417)；可见紫外分光光度计(日立，U-2001)，凝胶成像系统(江苏捷达科技，JD801)；电子秤(JM-A20001/中国)。

1.4 运动及补充甲鱼油方案

本次运动方案在本实验室前期的运动方案基础上进行改良[5]。运动组大鼠进行跑台适应性练习，3～5次/天，共5 d。运动干预为大鼠运动跑台的坡度0°，速度为15 m/min，15 min，组间休息5 min，4组/次，1次/天，每次总运动时间为60 min，每周5次，持续8周。

甲鱼油补充方案为OF组直接补充甲鱼油，OBF组运动后休息1 h补充甲鱼油，0.3～0.4 ml(人体推荐量4.8 g/60 kg的4倍)灌胃，其他组灌胃相等剂量的生理盐水，1次/天，每周5次，持续8周。本实验室甲鱼油采用新鲜甲鱼做原材料，采用索氏提取法提取，主要成分为微量元素和多不饱和脂肪酸。(本次实验甲鱼油由安徽省生物资源保护和利用重点实验室聂刘旺教授提供，纯度为99.9%)。

1.5 采样与测试

大鼠经过8周干预后停止运动2 d，随后禁食12 h，禁水6 h。用水合氯醛溶液(10%，3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，成功麻醉后剖腹取腹主动脉血液，分离血浆，取部分血浆测血糖，剩余血浆待测胰岛素和Vaspin浓度。采集大鼠肾脏和睾丸周围内脏脂肪组织，取部分含血管少的脂肪立即置于含有Trizol的EP管中，待进一步Vaspin mRNA 表达的测定；另取部分内脏脂肪组织包裹于铝箔纸中，待进一步Vaspin蛋白质表达的测定。计算胰岛素抵抗[IR =(G0×I0)/22.5，I0为空腹血浆胰岛素含量(mU/L)，G0为空腹血糖浓度(mmol /L)]。所有待测样本均保存于-80℃冰箱。

1.6 qRT-PCR测定内脏脂肪组织Vaspin mRNA表达

Vaspin的引物：上游5'-ACTGTGGCGGGAATTGCTCTAA-3'，下游3'-CACAGAC- ACAGGCACTGATGA-5'；β-actin的引物：上游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游5'-GCGGCAGTGGCCATCTC-3'。

用Trizol在脂肪组织中提取总RNA，以总DNA为模板反转录成cDNA，PCR扩增：95℃反应条件下预变性2 min→变性10 s，60℃的反应条件下退火60 s→延伸60 s，扩增40次循环；熔解曲线：60℃→95℃，每5 s升温0.3℃，Vaspin Tm值为79.5℃。以上实验得出数据，阈值与Ct值由软件自动得出，△Ct = Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-△△Ct法来进行相对定量。得出Vaspin qRT-PCR数值均扩大1 000倍。

1.7 Western blot测定内脏脂肪组织Vaspin蛋白表达

使用SDS-PAGE凝胶电泳进行转膜，将凝胶上的Vaspin蛋白质移至PVDF 膜上。室温下使用TBS将膜浸湿后移至封闭液中，脱色摇床上摇动封闭1 h；用封闭液将内参一抗(1∶1 000)、兔抗(1∶500)、4℃孵育过夜，用TBST室温下脱色摇床上清洗4次稀释，使用同样的方法准备二抗稀释液(1∶2 000)并与膜接触，室温下孵育1 h后，脱色摇床上用TBST清洗5次。进行化学发光反应，扫描胶片，用Image J2和凝胶图象处理系统软件分析目的条带的净吸光度值。

1.8 ELISA测定各组血浆Vaspin浓度

通过ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的双抗体夹心法，测定血液样本中Vaspin及胰岛素浓度。制作Excel表格，横坐标为标准品浓度，纵坐标为对应OD值，绘制标准品线性回归曲线。Vaspin标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.997，曲线方程为y = 0.017x-0.035；胰岛素标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999，曲线方程为y = 0.020x+0.008，曲线方程代入Excel表中，得到的相应浓度值乘以5则为样本实际浓度。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 运动、甲鱼油及运动+甲鱼油对老年肥胖大鼠IR的变化影响

与OA相比，8周干预后，OB、OF和OBF血浆胰岛素水平下降，但各组间均无统计学意义(P>0.05)；OB、OF和OBF血糖水平明显降低(P<0.05)；OB、OF和OBF 的IR明显降低(P<0.01)。与OBF相比，8周干预后，OB和OF的血浆胰岛素、血糖和IR在各组之间均无统计学意义(P>0.05，表1)。

Tab. 1 The levels of insulin, blood sugar and insulin resistance in rats after exercise

2.2 运动、甲鱼油及运动+甲鱼油对内脏脂肪组织Vaspin的mRNA表达、蛋白表达以及血浆浓度的影响

与OA相比，8周干预后，OB、OF和OBF的内脏脂肪组织Vaspin mRNA表达明显降低(P<0.01)；OB、OF和OBF的内脏脂肪组织Vaspin蛋白质表达明显降低(P<0.01)；OB、OBF的血浆Vaspin浓度明显降低(P<0.05，P<0.01)，OF的血浆Vaspin浓度下降，但无统计学意义(P>0.05)。与OBF相比，8周干预后，OB和OF 的内脏脂肪组织Vaspin mRNA表达、蛋白质表达和血浆浓度在各组之间均无统计学意义(P>0.05，表2，图1)

Tab. 2 Vaspin mRNA and protein expressions in visceral adipose tissue，and plasma vaspin concentration

Fig. 1 Vaspin protein expression in visceral adipose tissue

3 讨论

脂肪因子Vaspin是由Hida等[3]发现于OLETF大鼠的内脏脂肪组织中，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。Kloting等[6]研究发现，肥胖个体的内脏脂肪中Vaspin mRNA表达量明显高于正常体重者，且Vaspin在超重和肥胖者的内脏脂肪组织中的蛋白表达明显高于皮下组织，说明Vaspin与肥胖密切相关且在内脏脂肪组织中表达更明显。吴光秀等[7]通过高脂饲料诱导肥胖及IR的大鼠16周后，大鼠的血浆Vaspin水平以及肝脏组织Vaspin mRNA、蛋白质表达均明显提升，通过进一步慢性持续输注外源性Vaspin，大鼠体内高糖状态得到了改善。动物实验发现[8]，高脂饮食诱导的SD幼鼠脂肪组织Vaspin浓度高于正常饮食SD幼鼠，通过对SD幼鼠脂肪组织Vaspin及各项指标进行相关分析发现，Vaspin与SD幼鼠的腰围、内脏脂肪重量呈正相关。本实验研究表明老年肥胖大鼠体内IR和Vaspin表达均明显高于其他干预组，Vaspin作为脂肪因子与肥胖及IR的关系密切。

研究显示IR的发生与胰岛素受体信号传播异常有关，其中PI3K途径是改善IR调节糖脂代谢的重要途径[9]。Vaspin作为新发现的脂肪因子，其对IR的影响途径成为近些年的研究热点。刘萍等[10]研究发现，在地塞米松诱导的IR模型中，信号通路IRS-1/PI3K/PAKT明显被地塞米松抑制，在使用Vaspin干预后，抑制效果明显减弱。另一项实验发现Vaspin可以通过IRS-2/PI3K/AKT-B/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路和NF-kB炎症通路，促进棕榈酸诱导的胰岛素β细胞分泌[11]。Liu等[12]通过对IR动物模型体内IRS/PI3K/AKt/GLUT信号蛋白进行检测，发现Vaspin能降低肝脏、骨骼肌和脂肪中p-IRS-1(p-IRS-2)与IRS-1(IRS-2)的比值，增加p-AKt与AKt的比值，促进GLUT4在骨骼肌和脂肪组织上的膜位移。除此之外，该研究还发现Vaspin可抑制NF-kB通路成分及下游炎症因子的表达，减轻体内炎症状态。推测Vaspin可通过作用于PI3K途径和炎症通路来改善动物模型体内的IR。在本次实验中老年肥胖大鼠体内均有高IR和Vaspin的高表达，这可能是大鼠的机体应对体内炎症和高IR的一种机制，通过应激性的增高Vaspin的表达来改善体内的代谢紊乱。

运动可提高骨骼肌GLUT4表达，进而促进骨骼肌等相关组织对糖的利用[13]。除此之外，研究发现有氧运动能够增加抗炎因子脂联素的表达[14]，降低炎症因子的应答能力，改善老年肥胖大鼠的糖脂代谢、胰岛素敏感性、血糖水平[15-16]。本实验室前期研究发现，通过不同运动强度干预老年肥胖大鼠，中低强度均可明显降低大鼠内脏脂肪组织Vaspin mRNA、蛋白表达[17]。甲鱼油作为可食用油脂，研究认为鱼油中富含的多不饱和脂肪酸有利于保持葡萄糖的正常代谢，增加肝脏对葡萄糖的摄取[18]。目前有关甲鱼油与Vaspin的研究较少，两者之间的关系尚不清楚。本次实验通过运动、甲鱼油以及运动+甲鱼油干预老年肥胖大鼠，发现干预后三组老年肥胖大鼠的Vaspin表达、血糖水平均有了明显下降，IR得到改善。考虑到老年肥胖大鼠体内的高Vaspin表达可能是为了抵抗体内的代谢紊乱的一种应激机制，推测干预后的老年肥胖大鼠体内IR得到了改善，代谢紊乱恢复正常，因此Vaspin的表达也随之降低。在本次实验中，我们使用了三种干预方式，但干预后各组之间的老年肥胖大鼠的Vaspin表达、血浆Vaspin浓度、胰岛素及血糖的结果均没有显著差异，对IR的改善效果也没有差异。结果说明这三种干预方式的效果一致，运动+甲鱼油没有比运动或者甲鱼油表现出更好的效果，说明这两者之间没有很好的协同作用。在本次实验中，运动和甲鱼油干预都取得了相同的效果，推测这两种干预对老年肥胖大鼠的影响有上限，在达到上限后效果减弱，所以运动+甲鱼油才没有取得更好的效果。目前有关运动+甲鱼油的相关研究较少，有待进一步研究。

总而言之，老年肥胖大鼠内脏脂肪组织中Vaspin的高表达可能是对体内IR的应激反应。运动、补充甲鱼油以及运动结合甲鱼油在改善IR的同时，Vaspin的表达也会随之降低，推测Vaspin的高表达可视为IR的危险信号。运动、甲鱼油、运动+甲鱼油均能改善老年肥胖大鼠的IR，但尚未发现二者之间有较好的协同作用。

(衷心感谢安徽省生物资源保护和利用重点实验室聂刘旺教授与夏兴权教授为本次实验提供帮助。)