3种经济头足类透明标本的制作方法*

陈栋林 万永文 鲍镇宁 王奎钦 董乃铭 郑小东

（中国海洋大学水产学院 山东青岛 266003）

将动物某一器官制成半透明或透明的状态，便于直接观察内部构造，这种标本称为透明标本。与目前利用福尔马林、酒精等保存的标本相比，透明标本有许多显著的优点，例如可长期保存、观赏性高等,在教学和科学普及方面都有重要的应用价值［1-3］。在我国，透明标本的制作技术起源于上世纪50年代［3］，制作过程主要为骨骼染色。近年来,透明标本制作技术的发展应用范围已扩展至鱼类［1］、蛙类［4］和小鼠［5］等，关于头足类透明标本的制备方法国内却尚无报道。头足类是海洋软体动物的重要类群，与人们的经济、饮食生活联系甚广。本文以日本枪鱿、无针乌贼和短蛸3 种常见的头足类动物为对象,探索一种成熟的头足类透明标本制备方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选择新鲜、完整的头足类标本作为实验材料。其中,选取的日本枪鱿（Loliolus japonica）全长7～13 cm，无针乌贼（Sepiella japonica）全长7～13 cm，短蛸（Amphioctopus fangsiao）全长为10～21 cm。

1.2 试剂配制方法 茜素红溶液用1.0 g／L 茜素红和20.0 g／L 的KOH 配制而成；番红O 染色液采用0.1%的番红溶液配制而成；阿利新蓝染色液用1.0 g／L 阿利新蓝、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸馏水配制而成；甲苯胺蓝染色液用1.0 g／L 甲苯胺蓝、50%的95%酒精溶液、10%冰醋酸和40%蒸馏水配制而成。分色剂用10 g／L 的KOH、20%丙三醇和80%蒸馏水配制而成。透明液用10 g／L 的KOH、50%丙三醇和50%蒸馏水配制而成。

1.3 透明标本制备流程 透明标本制备主要包括墨囊处理、脱水固定、腐蚀透明、染色、分色、二次透明、封装保存等步骤。

在常温下,用蒸馏水或自来水将头足类动物表面冲洗干净后翻至腹面,轻轻提起胴体腹面肌肉，露出墨囊，用解剖针在墨囊上刺一个小口，用针按压墨囊，使墨汁流出，并用清水不断冲洗，至流水不再呈黑色为止。处理过程中要尽可能保持墨囊的完整性。将处理好的头足类动物平放于亚克力透明盒中，使其舒展，保持自然形态，添加95%的酒精，浸没标本1~2 cm，静置2 d，较大的标本可根据形态适当延长固定时间。

将脱水固定后的标本放入2% KOH 中进行透明处理。一般浸泡1~2 d，使标本表面色素基本溶解，标本变软即可。按染色剂配制方法（见1.2）提前配制好染色剂。将标本放入染色剂溶液中，浸泡1~2 d，使标本完全染色。

用3%过氧化氢溶液（或市售双氧水消毒液）对染色的标本进行分色，5~6 h 后,用分色剂再次对标本进行褪色处理2~3 d。将褪色后的标本置于透明液中继续透明处理2~3 周。最后将处理好的头足类标本放入丙三醇中封装保存，完成标本制备。

2 结果

2.1 不同染色剂的染色效果 使用了茜素红、番红O、阿利新蓝、甲苯胺蓝4 种染色剂，制备的3种头足类动物透明标本效果不同，详见表1。

表1 不同染色剂对日本枪鱿、无针乌贼及短蛸透明标本效果

本实验中使用了阿利新蓝、甲苯胺蓝、番红O、茜素红4 种染色剂,实验表明4 种染色剂均收效良好，能清晰地观察到内部结构。但这4 种染色剂的染色效果有所不同，茜素红、番红O 染色较浅，容易凸显头足类眼和头部的内部结构；甲苯胺蓝、阿利新蓝染色较深，更能凸显头足类触腕、吸盘、齿的结构。不同种类的头足类染色效果也有所不同。对于日本枪鱿，染色凸显出了鳃丝、墨囊、角质颚、眼等结构（图1，本文附图见封四）；对于无针乌贼，染色凸显出了白色的海螵蛸结构（图2）；对于短蛸，染色突出了吸盘、眼、肝脏、性腺和角质颚等结构（图3）。

2.2 过氧化氢对标本褪色效果的影响 褪色过程中，使用了不同浓度的过氧化氢（0%、1.5%及3%），它们对无针乌贼、短蛸组织影响不同，即使在过氧化氢浓度很低的情况下，无针乌贼、短蛸肌肉表面仍会出现大量气泡，肌肉被严重腐蚀，呈现氧化发白的现象（图4a、图4b）。

为解决该问题，在实验中使用了甘油和氢氧化钾的混合溶液（KOH 10 g／L、20%丙三醇及80%蒸馏水）作为褪色液代替过氧化氢进行褪色步骤。褪色48 h 后，该褪色液不仅达到过氧化氢的褪色效果（触腕颜色变浅，能看到吸盘，头部内的结构逐渐显现），同时避免了标本产生大量气泡和氧化发白的现象（图4c）。

2.3 墨囊处理的影响 墨囊结构较为脆弱，在标本制备过程中容易破裂，导致标本头部被染黑，对标本结构的观察造成巨大的负面影响。因此，通过在标本固定前对墨囊进行处理，去除墨汁（见制备流程1.3），可成功地避免后期墨汁流出对形态结构观察的影响。

3 讨论

3.1 染色效果 在透明鱼类标本的制备过程中，普遍仅使用1~2 种染色剂（茜素红或阿利新蓝）。本实验分别使用了阿利新蓝、甲苯胺蓝、番红O、茜素红4 种染色剂进行单独染色,取得了较好的效果。

造成不同染色剂染色效果不同的原因多样：1）从种类上看，日本枪鱿个体较小，肌肉层薄，容易被腐蚀透明,结构也展现得最为清晰；无针乌贼、短蛸肌肉层相对较厚，碱不易穿透，透明程度稍逊一筹。2）从染色机理上看，结合位点的不同也造成了一定的影响。茜素红可在碱性环境中结合钙，从而将骨组织和其他钙化结构染成红色［6］。番红O 是一种嗜碱性阳离子染料，能与软骨基质中丰富的阴离子糖胺聚糖结合成红色［7］。甲苯胺蓝是一种阳离子染料,其基团中的阳离子有染色作用,能与组织细胞的酸性物质相结合而染成蓝色［8］。阿利新蓝也是一种阳离子染料，能与组织内含有的阴离子基团如羧基和硫酸根形成不溶性复合物［9］。3）从染料的颜色上看，阿利新蓝、甲苯胺蓝颜色较深，对于外部细小的结构例如吸盘等有较好的凸显作用，但对于肌肉层较厚的无针乌贼、短蛸的内部结构观察来说，染料本身的深颜色具有一定的遮蔽作用,因此不是观察内部结构最佳的染料。番红O 和茜素红颜色相对较浅，经过分色、继续透明后能很好地显露出头部的内部结构。

3.2 褪色及透明效果 对染色后的日本枪鱿、无针乌贼及短蛸进行褪色处理,目的在于使浓染的部分褪至适当程度，使外套膜外层肌肉染色较浅，内部结构染色较深（分色），更好地凸显透明的效果。日本枪鱿的褪色可参照李婷等［10］对透明鱼骨骼制备中的脱色方法,使用过氧化氢对日本枪鱿进行褪色处理，但会出现不影响效果的少量气泡。对于无针乌贼、短蛸，使用过氧化氢进行褪色效果不佳。在无针乌贼、短蛸的褪色过程中，使用过氧化氢均会导致其表皮出现氧化现象或气泡。本实验利用分色液处理48 h,不仅能避免组织氧化，而且能达到相同的脱色透明效果。

3.3 方法改进 透明鱼标本的制备特点主要是将肌肉腐蚀殆尽后，再对骨骼进行染色，从而凸显出鱼的骨架结构［10-11］。而日本枪鱿、无针乌贼及短蛸标本中，由于骨骼等坚硬结构较少，不能将肌肉完全腐蚀后再染色,否则会导致形态不完整。因此，照搬已有的透明鱼类标本制备方法效果不佳。头足类的透明标本制作更注重将表层肌肉腐蚀透明，以突出其内部结构，同时以不同的染色剂进行染色，使得标本更具观赏性。制备好的头足类标本不仅能显示角质颚、触腕等外部结构，还能显示海螵蛸、内脏团等内部构造，既可用于教学与科研，又可作为科普宣传。

致谢：感谢中国海洋大学水产学院贝类遗传育种实验室对本项目的支持,感谢中国海洋大学水产学院姜典航、唐艳、许晨曦、南泽、陈智威等研究生在样品采集、鉴定和实验操作中给予的帮助。