lncRNA-47491、lncRNA-49770 和lncRNA-51636在发生炎症反应仔猪肝脏和脾脏中的表达分析

徐 鑫，黄兴法，王秀英，汪文俊，朱惠玲，刘玉兰，张 晶*

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430074）

内毒素是革兰阴性菌外膜上的脂多糖（LPS）成分，是危害畜禽健康的主要致病因子之一。LPS 可通过激活TLR4 和NOD 信号通路引起大量的炎性细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）[1]。这些因子的过量释放可引起动物机体的炎症反应，造成组织损伤和功能紊乱，影响动物健康。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类自身不编码蛋白的转录本长度大于200 个核苷酸的RNA 分子，其主要参与转录调控及转录后调控、蛋白质运输和mRNA 降解3 类生物学功能[2]。越来越多的研究表明，lncRNA可能是炎症反应的关键调节因子，在许多炎症性疾病的发病机制中起着至关重要的作用[3]。lncRNA Mirt2 可抑制NF-κB 和MAPK 途径的活化并抑制促炎细胞因子的产生[4]。lncRNA HOTAIR 在LPS 诱导的脓毒症小鼠的心肌细胞中显著上调，对p65 磷酸化和NF-κB 活化具有正调节作用[5]。lncRNA MALAT1 敲除可通过上调miR-146a 的表达来抑制LPS 诱导的小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S 和鼠肺泡上皮细胞系MLE-12 中的炎症反应[3]。

前期通过LPS 刺激仔猪外周血单核细胞（PBMCs）建立细胞炎症模型，经高通量测序及生物信息学分析后，获得了一系列炎症相关候选lncRNA，其中包括表达变化较显著的lncRNA-49471、lncRNA-49770、lncRNA-51636（未发表）。本研究通过给仔猪注射LPS 建立动物炎症模型，旨在研究肝脏和脾脏中炎性细胞因子及3 个lncRNA（lncRNA-49471、lncRNA-49770、lncRNA-51636）表达的变化。

1 材料与方法

1.1 试验试剂 LPS（大肠杆菌血清型O55：B5）购于Sigma 公司；RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）、Primescript®RT Reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTMRT-PCR 试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验仪器 RT-PCR 仪（7500 Real-time PCR system，ABI 公司）；梯度升降温功能PCR 仪（TaKaRa）；Nanodrop2000 超微量分光光度计（Thermo）；电泳仪、电泳槽（Bio-Rad）；Tanon-4100 凝胶成像系统（上海天能）。

1.3 试验设计 试验选取8 头21 日龄、体重（7.15±0.42）kg的杜×长×大三元杂交断奶仔猪，随机分为对照组、LPS 组，每个处理4 个重复，每个重复1 头猪。预试14 d 后，LPS 组腹腔注射100 μg/kg 体重的LPS，对照组注射等量生理盐水。4 h 后仔猪屠宰并取肝脏及脾脏样品置于液氮中备用。

1.4 基因表达测定 组织样品总RNA 提取、cDNA 合成、Real-time PCR 参照Liu 等[6]的方法。测定基因包括TNF-α、IL-1β、IL-6、lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636。以GAPDH为内参基因，Real-time PCR所有数据均采用Livak 等[7]的2-△△Ct法进行分析。引物由武汉擎科生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 基因的引物序列

1.5 靶基因预测 从生物信息学的角度对lncRNA-47491、lncRNA-49770 及lncRNA-51636 调控的顺式靶标基因进行预测。lncRNA 与已知编码蛋白质基因的距离域值设定为lncRNA 的上下游100 kb 内。

1.6 统计分析 数据采用SPSS 22.0 统计软件进行独立样本T 检验，以P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 LPS 刺激对仔猪炎性细胞因子mRNA 表达量的影响由表2 可知，与对照组相比，LPS 刺激提高了肝脏和脾脏中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 表达量（P＜0.05），表明炎症模型建立成功。

2.2 LPS 刺激对仔猪肝脏、脾脏组织中lncRNA 表达量的影响 由表3 可知，与对照组相比，LPS 刺激可上调仔猪肝脏、脾脏中lncRNA-47491、lncRNA-49770 的表达量（P＜0.01）及lncRNA-51636 的表达量（P＜0.05）。

2.3 lncRNA 靶基因的预测 如表4 所示，预测得到lncRNA-47491、lncRNA-49770 及lncRNA-51636 均 存在多个潜在靶基因。

表2 LPS 对仔猪肝脏及脾脏TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表达量的影响

表3 LPS 对仔猪肝脏及脾脏lncRNA 表达量的影响

3 讨 论

LPS 是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，其诱导的炎症损伤模型非常经典。有研究显示，LPS 刺激4 h 肝脏炎症相关基因显著上升[8]；LPS 刺激脾脏3 h 时促炎因子表达量达到最大[9]。本试验选择用LPS 刺激仔猪4 h后取样测定，结果显示肝脏和脾脏中LPS 刺激均使炎性细胞因子mRNA 表达量显著上调，表明LPS 诱导了炎性细胞因子的大量释放，炎症模型建立成功。

目前研究发现，lncRNA 在不同组织中的生物学功能不同，具有组织和细胞特异性[10]。前期研究发现，lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 在 肝脏和脾脏中均表达丰富，因此对肝脏和脾脏中这3 个lncRNA 进行炎症反应差异表达分析（未发表）。本试验中，在肝脏、脾脏中，LPS 诱导的lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 表达量均显著上调。由此可见，在肝脏和脾脏中，lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 均参与了炎症反应。

表4 lncRNA 靶基因的预测

此外，靶基因预测结果显示TMEM235、AFMID、PGS1、TK1、BIRC5和SYNGR2为lncRNA-47491 和lncRNA-51636 的靶基因；THOC6、SRRM2、PRSS21、PRSS33、PRSS41、FLYWCH1、FLYWCH2、KREMEN2、CLDN6、CLDN9、PKMYT1和TNFRSF12A为lncRNA-51636的靶基因。其中与炎症密切相关的基因有TMEM235、PGS1、TK1、BIRC5、SRRM2、TNFRSF12A、CLDN6和CLDN9。TMEM235在过敏性气道炎症表型（中性粒细胞性哮喘小鼠模型）中上调[11]。PGS1可以编码磷脂酰甘油磷酸合成酶。研究表明，LPS 刺激软骨细胞8 h 使其蛋白表达量显著下调[12]。TK1即胸苷激酶1，是脱氧核糖核苷酸代谢的补救途径中的关键酶。有研究发现，呼吸系统急性炎症病人血清细胞质TK1水平显著高于健康组及呼吸系统肿瘤病人，表明TK1参与炎症反应[13]。BIRC5（存活蛋白）是凋亡蛋白家族抑制剂的重要成员，涉及多种癌症类型，且在控制炎症性疾病中发挥着作用。研究表明，BIRC5为miR-203 靶标，且miR-203 和BIRC5 siRNA 均显著抑制TNBC 细胞中的细胞增殖[14]；在支气管炎性细胞存活和凋亡的不平衡调节诱导的哮喘疾病中，BIRC5mRNA 水平有较高表达[15]。SRRM2参与前mRNA 剪接，其在博来霉素诱导的肺损伤炎症反应模型中差异表达（较对照组显著下调）[16]。CLDN6和CLDN9是紧密连接蛋白家族成员。研究显示过表达CLDN6可改善呼吸屏障炎症[17]；CLDN9在瘤样细胞瘤中表达明显高于正常垂体组织[18]，且有药物可通过上调CLDN9表达来缓解缺氧诱导的人心脏微血管内皮细胞损伤[19]。TNFRSF12A即肿瘤坏死因子受体亚家族成员12A，与Toll 样受体信号通路相关，参与LPS 诱导的机体炎症反应[20-21]。因此本研究中的这3个lncRNA 可能通过调节这些基因的表达从而在炎症反应中发挥作用。

通过试验发现，仔猪肝脏和脾脏中的lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 均在LPS 诱导的 炎症反应中发生了表达变化，但具体的功能及调控机制仍不清楚，后续将通过预测的潜在靶基因进行深入研究。

4 结 论

LPS 刺激可诱导肝脏和脾脏产生大量炎性细胞因子。通过对肝脏和脾脏中lncRNA-47491、lncRNA-49770、lncRNA-51636 的差异表达分析可以看出其可能参与了机体的炎症反应，且通过靶标基因的预测提示3 个lncRNA 可能发挥不同的调控作用。