甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟质量及卵丘细胞的影响

王禹盟，齐佳佳，余思聪，郑 鑫，李子跃，梁 爽，李 所*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062）

随着动物胚胎工程技术的发展，对高质量成熟卵母细胞的需求日益增加。由于体内成熟的卵母细胞获得途径和数量的限制，卵母细胞体外成熟（IVM）成为获得成熟卵母细胞的重要途径。相较体内成熟而言，IVM由于脱离了体内微环境，导致卵丘扩散不完全[1]或核质成熟不同步等现象发生，严重影响着卵母细胞的成熟质量。因此，模拟体内成熟环境是解决卵母细胞成熟质量低下的有效途径。大量研究表明在体外成熟培养液中添加卵泡液能影响卵丘扩散和细胞质成熟。而甘氨酸（Glycine）则是输卵管液、子宫液及卵泡液中含量最高的氨基酸，对卵母细胞的发育起着至关重要的作用[2]。虽然甘氨酸被认为是自然界中结构最简单的非必需氨基酸，但目前研究表明，哺乳动物体内合成的甘氨酸并不能满足机体代谢需求，仍需要外源补充[3]。近年来，关于甘氨酸在卵母细胞体外培养中的研究逐渐增多，研究结果均证实添加甘氨酸可显著增加卵母细胞IVM 及体外受精（IVF）效率[4-7]。但此前研究均联合使用丙氨酸、精氨酸等氨基酸，对甘氨酸的作用效果并未深入研究。本实验室前期研究已证明，6 mmol/L 甘氨酸能减少活性氧（ROS）水平、改善线粒体功能，减少细胞凋亡，从而提高猪卵母细胞体外成熟率和胚胎发育率[8]。本实验将进一步研究甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟质量及卵丘细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 卵母细胞的体外成熟培养 猪卵巢是从当地屠宰场取回，选取直径为3～6 mm 的卵泡，注射器抽出卵泡液及其中的卵子。在TL-HEPES 洗液中用玻璃吸管挑选致密且胞质均匀、卵丘细胞在3 层以上的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte-Complexes，COCs）用于体外成熟培养。用TL-Hepes 液洗涤 3 遍后置于IVM 培养液中，38.5℃、5% CO2饱和湿度环境培养，体外成熟培养液采用NCSU-37 基础培养液，添加10% pFF、1 mmol/L dbcAMP、10 IU/mL hCG、10 IU/mL PMSG培养22 h 后，换液至无激素的培养液中继续培养22 h直至44 h COCs 体外成熟。NCSU-37 基础培养液中添加6 mmol/L 甘氨酸作为甘氨酸处理组，不添加组作为对照组，进行后续实验。

1.2 卵丘细胞扩散程度测定及卵丘收集 卵母细胞IVM培养至44 h，直接在倒置显微镜（IX70，Olympus）下测量卵丘细胞扩散情况，分别测量对照组和甘氨酸组卵丘扩散后COCs 的2 条垂直直径，记录后统计，每组测量30 个。另用吹吸法，利用小孔玻璃管反复吹吸COCs，机械地剥离掉卵丘细胞，分别收集卵丘细胞和成熟裸卵用于后续实验。

1.3 卵母细胞成熟、死亡的判定 将脱去卵丘细胞的裸卵放在体外培养（IVC）培养液中洗涤3 次，显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞，且细胞膜界限清晰的卵母细胞用于后续试验，并认定排出极体、细胞膜界限清晰为达到核成熟，将卵母细胞细胞膜没有清晰界限的卵子判定为死亡。

1.4 流式细胞术检测卵丘细胞凋亡 将收集的卵丘细胞收集于1.5 mL 离心管中，4 %的多聚甲醛液中室温下固定30 min，置低温离心机，1 000 r/min 离心15 min，弃上清，管底细胞用 Annexin V-FITC 检测试剂盒的说明书方法进行染色。即加入PBS 悬浮再离心后弃上清液，将细胞置于100 μL Binding Buffer 重新吹悬，随后加入Annexin V-FITC 5 μL 和 PI 5 μL，轻轻吹打混匀，在室温下避光共孵育10～15 min。

检测细胞凋亡水平：各处理样品分别加 100 μL Binding Buffer 稀释，转入测试管内，用流式细胞仪检测。检测需在 1 h 内完成。Annexin Ⅴ和PI 为2 种不同颜色的染料，可区分凋亡细胞和死亡细胞。分别用对照（+）和对照（-）来校准凋亡细胞，统计各处理组的细胞凋亡率。

1.5 猪卵母细胞内GSH 染色 成熟脱卵丘的卵母细胞内GSH 浓度采用CellTracker blue CMF2HC 进行染色，卵母细胞在38.5℃下，在添加10 μmol/L Cell Tracker Blue CMF2HC 的培养液中培养30 min，用含0.1%（w/v）PVA 的D-PBS 洗涤3 次，然后置于50 μL 液滴中。在荧光显微镜下测量荧光（滤光片在370 nm 激发下），使用软件对荧光强度进行定量。实验重复3 次，每组15～20 个卵母细胞在每个重复。

1.6 成熟卵母细胞中MPF 和MAPK 的测定 收集成熟卵母细胞于PBS+0.1%PVA 的溶液中洗涤3 次，采用反复冻融法裂解细胞。用猪MPF 和MAPK 测定ELISA试剂盒（上海科兴生物，中国）进行测定，参考Li[9]的方法，按照程序测定。用酶标仪对样本进行检测。样品中的猪MPF 和MAPK 通过比较与标准曲线来确定。

1.7 荧光定量PCR 检测各基因 mRNA 表达情况 总mRNA提取用Dynabeads mRNA Direct Kit（Dynal Asa，Oslo，Norway），具体方法参考说明书。RNA 提取浓度和纯度使用Nanodrop ND-1000 分光光度计（Biolab，Carmel，IN）进行定量，用于cDNA 合成的试剂盒从 Invitrogen 公司（Grand Island，NY）购买。引物由 Invitrogen 公司合成，本实验中使用的所有引物列表见表1，GAPDH基因作为看家基因。RT-PCR 采用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA）和Rotor-Gene™6000 实时旋转分析仪进行。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

1.8 统计分析 每组实验均重复3 次以上。数据用平均值±标准误表示。采用SPSS 23.0 统计软件的t检验方法进行数据分析。通过Nikon Instruments Software Basic Reserch 对平均免疫荧光强度进行测定及分析。qPCR 结果分析采用经典的2-△△Ct法。P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甘氨酸对猪卵母细胞卵丘扩散的影响 体外成熟培养猪卵母细胞前后，分别测量并记录COCs 的直径（图1），检测卵丘细胞扩散程度，与培养前卵丘细胞平均直径相比，6 mmol/L 甘氨酸处理组卵丘细胞扩散平均直径显著高于对照组（表2）。

表2 猪卵母细胞在6 mmol/L 甘氨酸浓度下卵丘扩散的情况

2.2 甘氨酸对成熟卵丘细胞凋亡的影响 流式细胞术测卵丘细胞凋亡的结果表明（图2），甘氨酸处理组与对照组相比，虽然卵母细胞早期凋亡和晚期凋亡率均没有显著差异，但甘氨酸处理组的猪卵丘细胞总凋亡率明显下降，显著低于对照组。

2.3 甘氨酸对猪成熟卵母细胞中MPF 和MAPK 水平的影响 如图3 所示，甘氨酸处理组能极显著提高成熟卵母细胞中MPF 和MAPK 水平。

2.4 甘氨酸对成熟卵母细胞内GSH 水平的影响 如图4所示，甘氨酸处理组成熟细胞内的 GSH 荧光强度显著高于对照组。

2.5 甘氨酸对细胞成熟相关因子与卵丘凋亡因子的影响荧光定量 PCR 结果显示，甘氨酸处理组猪卵母细胞成熟相关因子BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA 表达量显著高于对照组（图5-A）；卵丘细胞中细胞抗凋亡因子Bcl2 的mRNA 表达量显著高于对照组（图5-B）。

3 讨 论

卵丘细胞活力对哺乳动物卵母细胞成熟、受精及后期胚胎发育具有重要的意义。卵丘细胞的扩散程度常作为判断卵母细胞成熟及成熟质量的主要标准。本团队的前期研究发现甘氨酸能提高猪卵母细胞体外成熟率[8]。本实验结果表明，甘氨酸处理能显著增加猪卵母细胞成熟后卵丘扩散直径，表明卵丘扩散对猪卵母细胞体外成熟具有促进作用。在体内，卵丘细胞的扩散是排卵前的重要步骤，若卵母细胞扩散异常，则会导致后期胚胎发育能力不足[10-11]。研究发现，卵丘细胞在扩散过程中分泌的一些因子与卵母细胞核和细胞质成熟功能相关[12-13]，卵母细胞也会分泌旁分泌因子调节卵丘细胞的功能，如BMP15、GDF9高表达不但可以帮助卵丘细胞完成扩展，同时能促进卵丘细胞对抗凋亡[14-15]。因此，卵丘细胞的生长、凋亡与卵母细胞的发育能力有密切关系。有研究报道，在人 IVF 胚胎移植后，卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞其妊娠率更高。Lee 等[16]研究表明，卵丘细胞的凋亡状态可预测 IVF 后胚胎的发育情况。以上研究均证实卵丘细胞的状态对卵母细胞的成熟及后期胚胎发育能力具有至关重要的作用[17]。本研究结果证实了6 mmol/L 甘氨酸具有降低猪卵丘细胞凋亡率的作用。对卵丘细胞凋亡相关基因的检测也表明，甘氨酸可以显著增加卵丘细胞抗凋亡基因Bcl-2的mRNA 表达，进一步证明甘氨酸能抑制猪卵丘细胞凋亡，这与前期研究中甘氨酸能提高卵母细胞成熟率和孤雌激活后的胚胎发育率的结论一致。而其原因与甘氨酸能显著降低ROS水平[8]并促进BMP15、GDF9等基因的表达有关。

除了卵丘细胞状态可判断卵母细胞成熟及质量，GSH 作为哺乳动物体内重要的抗氧化物质，也是卵母细胞胞质成熟的重要标志[18]。甘氨酸与谷氨酸、半胱氨酸共同组成GSH，并参与卵母细胞的成熟。本研究结果也证实甘氨酸可以促进卵母细胞胞质内的 GSH 水平的提高，进一步促进卵母细胞胞质成熟，提高卵母细胞成熟质量。在前期实验中，甘氨酸处理显著提高了猪卵母细胞体外成熟率，减少ROS 水平[8]，本实验结果与前期研究相符合，同时甘氨酸也能阻滞卵丘细胞的凋亡。MPF 和MAPK 是卵母细胞减数分裂过程中的特定调节因子。MPF 是调控细胞周期的重要蛋白激酶，启动卵母细胞由G2 期进入M 期，因此，MPF 在卵母细胞成熟促进中起着关键作用。MAPK 是细胞外信号的中心传导物，与MPF 协同调节细胞周期。另有研究表明，在成熟的卵母细胞胞质中MPF 和MAPK 活性高于未成熟的卵母细胞胞质中的活性[19]，因此猪卵母细胞中活化的MPF 和MAPK 水平高低可判定细胞质成熟及成熟质量。本研究结果表明，甘氨酸组中MPF 和MAPK 的表达量显著高于对照组，说明甘氨酸能有效促进猪卵母细胞的成熟质量。结合之前孤雌激活的早期胚胎发育情况，甘氨酸处理后囊胚率也最高，与Li 等[9]观点类似，即 MPF 和 MAPK 活性保留，对后期的孤雌胚或者受精胚的发育提供了有利因素。

关于甘氨酸对细胞成熟及其成熟质量相关的因子检测中，本实验检测了BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA 表达情况。BMP15作为卵母细胞特异性分泌因子，在卵泡的腔前发育中起着重要的作用[20]。研究表明，BMP15在猪卵母细胞中表达，在猪卵丘细胞中不表达[21]，高水平表达的BMP15可抑制猪卵丘细胞的凋亡[22]，与本结果相似。GDF9是卵泡生长发育和卵巢功能的重要调节因子，且与卵丘细胞凋亡息息相关，进而影响卵母细胞自身质量和受精后胚胎的发育。CyclinB1是MPF 的亚基，参与有丝分裂和减数分裂的调节，其与CDK1结合，从而促进卵母细胞进入减数分裂的后期。C-MOS在MAPK 通路中起非常关键的作用。这些因子在甘氨酸处理下均显著高于对照组，进一步说明甘氨酸可提高卵母细胞的成熟质量。

4 结 论

本研究结果证明甘氨酸能显著提高猪卵母细胞体外成熟质量和卵丘扩散情况，并且降低卵丘细胞凋亡。