拟南芥根毛功能基因AtGDPD-Like3关键氨基酸位点鉴定

王 爽 程玉祥 夏德安

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室,哈尔滨 150040)

根毛是由植株根系表皮的单细胞向外凸起形成的管状结构，是植物营养吸收的主要器官[1]。根毛发育是细胞极性生长的一种极端类型——顶端生长，可在十几小时内向特定方向生长十几倍的细胞长度[2～3]。这种顶端生长是一个复杂的过程，受到活性氧，钙离子浓度，磷脂肌醇，囊泡运输，细胞骨架等诸多因素的精细调控[4～7]。例如，活性氧的产生与定位能决定植物细胞的形态发生，活性氧含量的增加可改变细胞壁的刚性，促进了根毛的顶端生长[8～9]；上游信号激活根毛顶端质膜上的钙离子通道，调节钙离子内流，使胞内钙离子浓度增加，形成钙离子浓度梯度，从而调控根毛顶端生长[10～11]。

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)催化甘油磷酸二酯水解成甘油-3-磷酸和相应的醇类，在原核生物和真核生物的各种生理过程中起着重要作用[12]。拟南芥GDPD基因家族可分为GDPD和GDPD-Like(GDPDL)两个亚族。AtGDPDL基因家族包括7个成员(AtGDPDL1-7)，与传统的拟南芥GDPD不同，拟南芥GDPDL包含两个非典型GDPD结构域[13]。此外，研究显示AtGDPD-Like3基因在拟南芥的根毛组织中高丰度表达，其次是叶柄，下胚轴和幼叶。该基因的表达与拟南芥的根毛形态发生密切相关，是根毛伸长所必须的。在AtGDPD-Like3和AtGDPD-Like1双突变体shv3svl1中，细胞壁分析显示结晶纤维素含量减少致使细胞壁组分发生改变，导致严重的根毛细胞发育缺陷[14～15]。然而，影响AtGDPD-Like3蛋白功能行使的关键氨基酸位点尚不清楚。

在本研究中，对AtGDPD-Like3保守的氨基酸列序位点分析，推测出Leu521、Ser538、Leu544、Val556、Glu621、Asp628可能是AtGDPD-Like3蛋白行使功能的关键位点。进一步我们创制AtGDPD-Like3的Ser538、Val556、Asp628单点突变型，基于遗传转化策略验证其能否恢复atgapdl3突变体根毛缺陷表型，筛选AtGDPD-Like3蛋白质的功能关键位点，为进一步探究AtGDPD-Like3蛋白功能行使的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物总RNA提取试剂pBIOZOL Reagent购自Bioflux公司，植物基因组DNA快速提取试剂购自Bioteke公司，pMD18-T载体、cDNA第一链合成试剂PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser和MutanBEST Kit试剂盒购自TaKaRa公司。高保真DNA聚合酶KOD-Plus购自Toyobo公司,胶内DNA回收试剂盒Silica Bead DNA Gel Extrction Kit购自Thermo Scientific。pGWB2载体购自Invitrogen公司，基因引物合成以及DNA测序也由Invitrogen公司完成。anti-FLAG鼠单克隆抗体购自AbMART公司，HRP标记的羊抗鼠IgG二抗购自Abcam公司。

1.2 试验方法

1.2.1AtGDPD-Like3氨基酸序列分析

AtGDPD-Like3基因信息从拟南芥TAIR10数据库中获取(https://www.arabidopsis.org/)，NCBI-BLAST检索、获取其同源基因推测氨基酸序列，用BioEdit比对分析保守氨基酸序列。

1.2.2 植物总RNA、基因组DNA提取和cDNA第一链合成

植物总RNA的提取和cDNA第一链的合成参照试剂盒的提取步骤依次进行。用一步法植物基因组DNA快速提取试剂提取植物基因组DNA。

1.2.3 PCR扩增和氨基酸位点突变

PCR扩增体系20 μL：13.5 μL ddH2O，2 μL dNTPs(2 mmol·L-1)，2 μL 10×Taq Buffer，上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反应程序：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 s，引物退火温度56℃，延伸30 s。T-DNA鉴定和ACTIN2基因扩增分别为30和25个循环。氨基酸位点突变的制备参见MutanBEST Kit所提供的方法。

1.2.4 T-DNA插入基因突变体鉴定

“老年痴呆症”难听，“阿尔茨海默病”难记。一个病名引发的讨论，有助于加强公众对它的认知，减少对它的歧视。在中国，由于老龄化加剧和医保体系尚未完善，阿尔茨海默病的防治将面对更为复杂的困境

提取待鉴定的植株基因组DNA作模板，使用SALK_137845-LP和SALK_137845-RP、SALK_137845-LP和LBb1、LBb1和SALK_137845-RP三对引物进行交叉PCR扩增，对T-DNA插入突变体进行鉴定；从琼脂糖胶上回收扩增的DNA片段，连接pMD18-T载体，对插入片段克隆测序。试验中所用引物及序列参见表1。

1.2.5 植物表达载体构建及拟南芥遗传转化

植物表达载体的构建采用Gateway系统[16]。拟南芥遗传转化采用浸花法[17]，选用达到8周龄拟南芥用于遗传转化。

1.2.6 蛋白质Western印迹分析

拟南芥转基因植株体内FLAG-融合蛋白质水平检测采用Western免疫印迹法[18]。提取植物组织蛋白质用于SDS-APGE，将SDS-胶中蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脱脂奶粉TBST 4℃封闭过夜。然后加入1∶2 000稀释的anti-FLAG鼠单克隆抗体于室温下孵育1 h 30 min；TBST洗膜3次后，加入1∶2 500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗于室温下孵育1 h，TBST洗膜3次后，用ECL化学发光显色液进行显色。

表1 所用引物及序列

1.2.7 拟南芥根毛形态观察及量化统计

对1/2MS培养基上生长7天的拟南芥幼苗，用体式显微镜观察其根毛表型。根毛长度和密度的统计均取来胚轴与根交界处自上而下4 mm区间的所有根毛。数据统计采用使用SPASS统计软件进行，采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 AtGDPD-Like3单突变位点选择

鉴定AtGDPD-Like3基因T-DNA插入突变体时，以SALK_137845植株基因组DNA为模板，用引物SALK_137845-LP和SALK_137854-RP未扩增出目标带，而SALK_137845-RP和LBb1扩增出目标带，两者表明T-DNA插入在该基因区域，DNA测序显示插入位点在At4g26690第7个外显子260 bp处。RT-PCR分析显示未检测到AtGDPD-Like3基因转录产物，因此SALK_137845是AtGDPD-Like3基因敲除突变体。

AtGDPD-Like3编码759个氨基酸，含有GDPD-Like结构域。选用大豆，毛果杨，油菜，甘蓝，高粱，玉米等22个物种的AtGDPD-Like3同源基因，推测氨基酸序列一致性比对显示Leu521、Ser538、Leu544、Val556、Glu621、Asp628是保守氨基酸位点(图1)，这些氨基酸位点可能是GDPD-Like结构域功能的关键位点。基于此，我们选取其中的3个保守位点Ser538、Val556、Asp628作为突变的目标，验证其位点的分子功能。

图1 AtGDPD-Like3及其同源蛋白氨基酸序列比对Fig.1 Amino acid sequence alignment of AtGDPD-Like3 and its homologous proteins

图2 AtGDPD-Like3单点S538A、V556A和D628A突变的载体构建 M.Marker；a. 1～3，FLAG-tag+N端信号肽片段；FLAG-tag+AtGDPD-Like3(去除信号肽部分)；FLAG-AtGDPDL3；b. 4，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3；c. 5～7，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A线性片段；d. 8～10，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A重组质粒PCR鉴定Fig.2 Construction of vectors of single site mutations S538A, V556A and D628A in AtGDPD-Like3, respectively a.1-3, N-terminal signal peptides plus FLAG fragment,FLAG-AtGDPDL3 without signal peptides and FLAG-AtGDPDL3; b. 4, pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3; c. pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628 A fragments; d. 8-10,PCR determination of pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628 A plasmids

图3 FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3转基因分子鉴定 a.转基因植株转录水平鉴定；b.转基因植株蛋白质含量鉴定，ACTIN蛋白质量作为定量内标蛋白；WT.野生型拟南芥；L1-4、L5-8、L9-11和L12-15，分别为FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3转基因植株Fig.3 Molecular identification of the transgenes of FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3 a.Detection of transgenic plants on the transcriptional level; b.Determination of transgenic plants on the protein level using the ACTIN protein as a control; WT. Wild-type Arabidopsis; L1-4,L5-8,L9-11 and L12-15 indicate the FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A,-D628A and FLAG-AtGDPDL3 transgenic plants,respectively

2.2 S538A、V556A和D628A单位点突变的构建

实验采用重叠PCR策略，将FLAG标签短肽融合在AtGDPD-Like3信号肽之后。以拟南芥cDNA为模板，分别用CDS-up/mR和mF/CDS-down两对引物进行PCR扩增，得到的产物(图2a:泳道1～2)混合作为模板，再用AtGDPD-Like3基因CDS-up/down引物进行扩增，得到FLAG-AtGDPDL3片段(图2:泳道3)。将之连接到pENTR/SD/D-TOPO载体上(图2b)，测序表明FLAG短肽序列融合在AtGDPD-Like3信号肽和GDPD-Like结构域之间。

以pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3质粒为模板，分别用3对单点突变引物S538A-up/down、V556A-up/down和D628A-up/down进行扩增，得到S538A、V556A和D628A单点突变FLAG-AtGDPDL3线性片段(图2c)。经末端磷酸化处理后自身环化，转化TOPO10。对菌落进行PCR鉴定，得到的片段与目标片段大小相符(图2d)，测序结果显示除指定位点突变外无其它位点碱基突变。用LR重组反应将pENTR/SD/D-TOPO载体上这4种FLAG-AtGDPDL3片段重组到pGWB2植物表达载体。将其转化GV3101农杆菌，用于拟南芥atgdpdl3突变体功能互补实验。

图4 AtGDPD-Like3的Ser538、Val556、Asp628位点对根毛表型的作用 a.WT；atgdpdl3突变体；FLAG-AtGDPDL3；FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A转基因植株根毛图；b.统计分析各植株根毛平均长度；c.统计分析各植株根毛平均密度Fig.4 Roles of Ser538,Val556 or Asp628 of AtGDPD-Like3 in root hair phenotypes a.Root hair photos of WT,atgdpdl3 mutants,FLAG-AtGDPDL3 and FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628A transgenic plants; b.Statistical analysis of root hair length in WT and transgenic plants; c.Statistical analysis of root hair density in WT and transgenic plants

2.3 点突变的AtGDPD-Like3转化atgdpdl3突变体

用浸花法对atgdpdl3突变体植株进行转化后，获得转FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A、FLAG-AtGDPDL3抗性植株4、4、3和4株系。以转基因植株cDNA为模板，用引物AtGDPDL3-RT-up/down进行半定量RT-PCR分析，结果显示FLAG-AtGDPDL3基因及其S538A、V556A和D628A单点突变形，在转基因植株中转录水平均较高(图3a)。用FLAG抗体对转录水平高的转基因植株进行免疫印迹，结果显示FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3表达量均较高(图3b)。这表明FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3在atgdpdl3突变体植株中均正常表达，这些材料用于接下来的根毛表型分析。

2.4 单点突变AtGDPD-Like3对atgdpdl3根毛缺陷表型恢复程度分析

在培养基上垂直培养7天后显微观察根毛生长情况显示(图4a)，T-DNA插入突变体atgdpdl3几乎不长根毛，表现根毛缺陷；FLAG-AtGDPDL3转入atgdpdl3突变体，能够完全恢复根毛缺陷表型；转入FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A对根毛缺陷恢复效果之间明显不同，S538A突变FLAG-AtGDPDL3是部分程度地恢复根毛缺陷，而V556A和D628A突变FLAG-AtGDPDL3却完全恢复根毛缺陷表型。

为了准确地显示这些遗传材料根毛表型的差异，对胚轴与根交界处起自上而下4 mm区间所有根毛长度和密度进行了量化统计(图4:b～c)。FLAG-AtGDPDL3、FLAG-AtGDPDL3-V556A、FLAG-AtGDPDL3-D628A转基因植株与野生型相比，根毛长度和密度几乎一致。没有明显差异；而FLAG-AtGDPDL3-S538A转基因植株根毛平均长度减少了25%，根毛平均密度减少了46%。这表明V556A、D628A位点突变不影响AtGDPD-Like3恢复atgdpdl3根毛缺陷表型，换言之Val556、Asp628位点不是AtGDPD-Like3蛋白质的关键位点。相反，S538A突变AtGDPD-Like3只是部分恢复atgdpdl3突变体根毛缺陷表型，表明Ser538位点是AtGDPD-Like3一个较为关键的位点。

3 讨论

根毛是植物重要器官之一，负责植物从土壤中吸收水份和矿质营养[19]。Jones等[20]采用突变体策略鉴定出多个参与拟南芥根毛发育的重要基因，其中RHM4是本研究的AtGDPD-Like3基因。在这里我们鉴定AtGDPD-Like3一个新的T-DNA插入突变体(SALK_137845)，该突变体atgdpdl3根毛生长严重缺陷，与rhm4突变体表型一样，实验转入FLAG-AtGDPDL3完全恢复atgdpdl3根毛缺陷，显示该基因对拟南芥根毛发育的功能。

在鉴定AtGDPD-Like3关键位点时，实验采用融合标签短肽FLAG策略。FLAG短肽含8个氨基酸，通常不影响目标蛋白质正常结构和功能，却方便用其肽抗体(anti-FLAG)分析目标蛋白质表达量。AtGDPD-Like3的N端含有信号肽，C端存在GPI锚[9]。为了不破坏GPI锚，确保FLAG-AtGDPDL3细胞内正确定位，实验把FLAG短肽融合在AtGDPD-Like3的N端信号肽之后。

用能否恢复atgdpdl3根毛缺陷策略，实验鉴定AtGDPD-Like3保守氨基酸位点Ser538、Val556和Asp628对根毛缺陷恢复效果。其中Ser538突变的AtGDPD-Like3只能部分恢复根毛缺陷，表明该位点是AtGDPD-Like3关键位点。它位点GDPD-Like结构域上，很可能是该酶活性依赖的重要位点。今后可以分析Ser538突变的AtGDPD-Like3酶学相关动力学性质，了解它是如果影响AtGDPD-Like3的。

此外，实验结果还表明AtGDPD-Like3存在其它的关键位点。由于AtGDPD-Like3包含两个GDPD-Like结构域[8]，这两个结构域的功能是否冗余还不清楚。本实验的Ser538突变位于第二个GDPD-Like结构域，第一个GDPD-Like结构域也可能行使作用。在本研究中只鉴定AtGDPD-Like3保守的3个单位点的作用，对于其他位点是否影响AtGDPD-Like3功能没有涉及。今后我们将采用双位点或多位点同时突变策略，来确定它们对AtGDPD-Like3行使功能的作用。