紫叶油菜硫同化还原酶基因APR2的克隆及在拟南芥中的遗传转化

张 宏，李 刚，韩凤英，赵福永

(长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025)

硫是植物生长必需的大量元素之一，是半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、谷胱甘肽(GSH)、维生素B1以及一些重要辅酶、辅基等生物合成的必需物质，其代谢产物在蛋白质合成、抗逆境胁迫、抗病虫害等多种生理活动中扮演着重要角色[1-3]。自然界中的硫主要以硫酸盐和硫化物的形式存在，高等植物生长发育所需的硫主要通过根系从环境中吸收[4]。与酵母、真菌等微生物不同，植物可以直接以腺苷5′-磷酰硫酸(Adenosine 5′-phosphosulfate,APS)为底物，在质体中APS还原酶(Adenosine 5′-phosphosulfate reductase,APR)作用下将其还原为亚硫酸盐进入次级代谢，是植物硫同化还原的主要形式[5-8]。

植物硫同化代谢通路及其关键酶基因在模式植物拟南芥中已研究得比较清楚[2-9]。拟南芥APR家族有APR1(PRH19)、APR2(PRH43)和APR3(PRH26)3个成员。APR是一类叶绿体靶向蛋白，N端均具有典型的叶绿体转运肽序列，其还原反应由GSH提供电子，不依赖于硫氧还蛋白[10-11]。3个APR成员编码产物的结构和功能高度相似，同时又各有特性。APR1和APR3之间的序列相似性高于它们与APR2之间的相似性，倾向于共调节表达，APR2的表达水平不受H2O2和茉莉酸的影响[12]。启动子功能分析表明，各个APR基因的表达具有较强的组织特异性，这对于其适应特定的硫营养环境非常重要[9]。apr1或apr2突变体的生长发育不受影响，与野生型无明显差别，说明它们在功能上具有冗余性。但是，APR1缺失可使APR总活性降低20%左右，而APR2缺失，APR总活性则降低80%，说明APR2对APS的还原占主导地位[6,13]。在拟南芥的自然变异体中，APR2的还原酶活性相差可达4个数量级[14]。

油菜是一种对硫需求量高的作物，每吨产量约需消耗10 kg纯硫[15]。油菜组织中硫含量低于3.5 mg/g(干质量)会表现出缺硫症状，如幼叶缺绿、生长缓慢、抗逆性和抗病虫能力下降等，最终导致油菜减产和品质下降[16]。李海渤[17]通过群体遗传定位、qRT-PCR和RNA-seq等分析充分证明，BnaA03g59800D(BnAPR2)是油菜品系6-1029紫叶性状的候选基因。比较发现，长江大学生命科学学院油菜课题组前期选育的紫叶油菜材料XY-PL的紫叶表型与6-1029极为相似，对XY-PL的APR2基因序列进行扩增和测序，结果表明，XY-PL与6-1029两种不同紫叶油菜材料中的APR2基因序列完全相同，与绿叶油菜品种中双11号来源的APR2序列则存在差异。为探讨XY-PL来源的APR2是否为控制其紫叶性状的基因，分别对绿、紫2种叶色油菜品种(系)中的APR2基因进行克隆和生物信息学分析，并采用转基因技术对目标表型进行验证分析，同时还对其分子调控机制进行讨论，以期丰富对油菜APR2基因结构和功能的认识，为芸薹属紫叶材料的创新提供新思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料

紫叶油菜品系XY-PL由长江大学生命科学学院油菜课题组选育，为甘芥杂交F8高世代重组自交系[18-19]；甘蓝型绿叶油菜品种中双11号(ZS11)种子为油菜课题组自交留种。2015年10月，将油菜材料均播种于长江大学西校区科研试验地，常规田间管理。拟南芥为野生型哥伦比亚生态型(Col-0)，用营养土种植于植物生长培养室[(22±2)℃，16 h/8 h(L/D)]中。

1.2 菌株、质粒与主要试剂

大肠杆菌(DH5α)、农杆菌(GV3101)感受态细胞均购自上海维地生物技术有限公司。质粒pCAMBIA1300为长江大学生命科学学院油菜课题组实验室保存。植物基因组DNA提取试剂盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit)、总RNA提取试剂盒(TransZol)、cDNA反转录试剂盒(One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)、平末端连接试剂盒(pEASY-Blunt Cloning Kit)、质粒提取试剂盒(Plasmid MiniPrep Kit)及高保真DNA聚合酶(FastPfu DNA polymerase)、T4 DNA连接酶、高纯度dNTPs等均购自北京全式金生物技术有限公司；凝胶回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit)购自南京诺唯赞生物技术有限公司；限制性内切酶购自Fermentas公司；其他试剂均为分子试剂级或分析纯。

1.3 XY-PL的紫叶性状观察及主要农艺性状测定

选取XY-PL完全展开的功能叶片，观察叶片上、下表面紫色分布，并用尖头镊子撕取上表皮进行显微观察。选取10株XY-PL植株，参考LI等[20]的方法提取和测定叶片花青素含量，参考唐延林等[21]的方法提取和测定叶片叶绿素和类胡萝卜素含量，以ZS11为对照。参考伍晓明等[22]方法对大田栽培条件下的XY-PL的株高、主花序长度、一次有效分枝数、有效分枝高度、角果长度、每角粒数、千粒质量、单株产量等主要农艺性状进行考查。

1.4 油菜APR2基因PCR扩增引物的设计与合成

依据拟南芥AtAPR2(At1g62180)对甘蓝型油菜参考基因组序列(V4.1)进行同源搜索，共获得2个APR2同源序列BnaA03g59800D和BnaC04g19270D，进一步针对BnaA03g59800D采用NCBI网站Primer-BLAST程序设计PCR特异扩增引物以及用于表达载体构建的表达元件(CaMV 35S启动子及其转录终止序列)等PCR扩增引物序列，并由北京擎科生物技术有限公司合成(表1)。

表1 研究所用引物Tab.1 Primer list of this study

1.5 油菜APR2的克隆与序列分析

于六叶期分别剪取XY-PL和ZS11嫩叶，按照试剂盒说明书步骤分别提取基因组DNA和总RNA。经浓度和完整性检测后，应用cDNA反转录试剂盒进行cDNA合成和PCR扩增。扩增程序为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s,40个循环；72 ℃ 7 min。扩增体系(50 μL)为：10×Buffer(Mg2+)5 μL、APR2-F(10 μmol/L)2 μL、APR2-R(10 μmol/L)2 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL、cDNA 模板 2 μL、PfuDNA聚合酶 2 μL、ddH2O 32 μL。PCR产物经电泳、回收后，按平末端连接试剂盒说明书构建连接反应体系，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB固体平板。37 ℃过夜培养，对抗性单菌落进行菌落PCR和质粒DNA酶切检测，各挑取10个左右菌落送北京擎科生物技术有限公司进行测序。

对测序获得的DNA序列及其推导氨基酸序列采用BioEdit 7.0、ChloroP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、MOTIF Search (https://www.genome.jp/tools/motif/)、MEGA-X(v10.0)等软件和在线网站进行序列比对、转运肽、结构域预测和系统进化分析。

1.6 APR2过表达载体构建与农杆菌工程菌株制备

以pCAMBIA1300为基本骨架，用KpnⅠ和XbaⅠ对质粒DNA进行双酶切，电泳回收大片段；用对应限制性内切酶分别酶切APR2cDNA、35S启动子及其转录终止序列扩增产物，并进行电泳、回收。将载体大片段、目的基因及各表达元件用T4 DNA连接酶进行连接。后续转化、阳性菌落鉴定和测序操作同1.5所述。

提取测序正确的质粒DNA，采用冻融法转化农杆菌感受态细胞。挑取农杆菌单菌落进行菌落PCR检测，将阳性菌落用含25%甘油的YEB培养基保存于-70 ℃中备用。

1.7 APR2过表达载体的拟南芥遗传转化

拟南芥遗传转化采用花序浸泡法[23]，略有改动。大体步骤为：将拟南芥种子灭菌处理，均匀播种于MS固体平板上，于4 ℃春化2 d后，置于植物生长培养箱 [(22±2)℃，16 h/8 h(L/D)]中培养。于四叶期将拟南芥幼苗移栽至营养土中培养至花期。剪掉主花序，待侧生花序有较多花蕾时，去掉已开放的花蕾及荚果用于浸染试验。活化保存的农杆菌菌株，挑单菌落接种于含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28 ℃、240 r/min培养至OD600约为0.8，离心收集菌体，用转化液(1/2MS培养基+50 g/L蔗糖+100 μL/L Silwet L-77)重悬浮沉淀至初始体积作为浸染液。将拟南芥花蕾在浸染液中浸泡30 s后用保鲜膜包裹，暗培养24 h后进行正常光照培养。待种子成熟后，分单株收取种子，记为T0代。

1.8 APR2转基因拟南芥的筛选、鉴定与叶色表型观察

将T0代种子按株系灭菌消毒后，均匀播种于含潮霉素(30 mg/L)的抗性平板上，以非转基因野生型种子为对照。2周后将根和叶发育正常的抗性苗移栽至营养土中，植物生长培养箱中培养，待10片左右莲座叶时，剪取叶片提取基因组DNA。用目的基因扩增引物进行PCR扩增检测，剔除假阳性植株，并按单株收获阳性植株种子，记为T1代。随后用潮霉素抗性平板继续对T1代种子进行筛选，按单株收获T1代抗性植株成熟种子，记为T2代。各株系取少量T2代种子用潮霉素抗性平板继续进行筛选，若幼苗群体无抗性分离情况，则表明该株系为阳性纯合株系，将部分幼苗进行移栽，收获T3代种子。自然晾干后，保存于4 ℃用于后续试验分析。观察并记录T0—T2代各株系的叶片颜色。

2 结果与分析

2.1 紫叶油菜XY-PL的紫叶性状及主要农艺性状

对紫叶油菜XY-PL叶片观察发现，上表面呈深紫色，下表面呈浅紫色，深紫色叶脉明显(图1A、B)。显微观察发现，紫色细胞主要分布在叶片角质层下的表皮层，栅栏组织和海绵组织等其他组织细胞均未见有紫色。从胞内分布来看，紫色大液泡充满整个细胞内腔(图1C)。

A.上表面(左为XY-PL,右为ZS11); B.下表面(左为XY-PL,右为ZS11); C.上表皮(400×)A.Upper surface(Left:XY-PL,Right:ZS11); B.Lower surface(Left:XY-PL,Right:ZS11); C.Upper epidermis(400×)图1 紫叶油菜XY-PL叶片颜色及上表皮显微观察Fig.1 Leaf color and microscopic observation of upper epidermis of purple-leaf rape XY-PL

分析XY-PL和ZS11叶片4种主要色素含量(图2)发现，XY-PL总色素含量平均为2.434 mg/g，其中花青素含量平均为0.862 mg/g(占总色素含量的35.41%)，叶绿素a含量平均为0.905 mg/g(37.17%)，叶绿素b含量平均为0.281 mg/g(11.54%)，类胡萝卜素含量平均为0.387 mg/g(15.88%)，而ZS11的总色素含量为2.057 mg/g，上述4种色素含量分别为0.025 mg/g(1.22%)、1.212 mg/g(58.92%)、0.380 mg/g(18.47%)、0.440 mg/g(21.39%)。 XY-PL叶片中的平均花青素含量约为ZS11的34.5倍，其中PL2植株花青素含量最高，达1.816 mg/g。

PL1—PL10为紫叶油菜品系XY-PL的10个单株编号PL1—PL10 represent 10 individual plants of purple leaf rape XY-PL图2 XY-PL与ZS11的叶片色素含量Fig.2 Pigment content in leaves of purple-leaf rape XY-PL and green leaf rape ZS11

2016年，在大田常规种植条件下，选取了10株XY-PL植株进行了农艺性状和产量性状考察。结果表明，XY-PL株型紧凑，株高为156.78 cm，主花序长度为38.56 cm，一次有效分枝数为10.68个，有效分枝高度为58.34 cm，角果长度为5.84 cm，每角粒数为10.82粒，千粒质量为4.44 g，单株产量为28.53 g。从产量性状结果来看，XY-PL的多个性状指标均接近于当前的一些优良甘蓝型油菜品种，如1.6 m左右的株高、10个左右的一次有效分枝数、4 g左右的千粒质量，但其主花序长度、每角粒数、单株产量等指标仍偏低。

2.2 油菜APR2的克隆与序列分析

考虑到GenBank中BnaA03g59800D(BnAPR2)被注释为5个外显子和4个内含子基因，不同于拟南芥的APR2基因结构，本研究用不同的油菜APR2特异扩增引物组合对XY-PL和ZS11的gDNA和cDNA进行扩增。以gDNA为模板，引物组合APR2-F/APR2-R2在2种油菜中均扩增获得了约2.3 kb的片段(图3A)；以cDNA为模板，引物组合APR2-F/APR2-R1在2种油菜中均扩增获得了约1.4 kb的片段(图3B)，而引物组合APR2-F/APR2-R2无扩增产物出现(图3C)。说明油菜中APR2的基因结构与AtAPR2相同，同为4个外显子和3个内含子。

对测序结果进一步分析表明，与ZS11的APR2序列相比，来源于XY-PL的APR2序列仅在第2个内含子存在2处缺失(14 bp和2 bp)，其余2个内含子序列完全相同。在XY-PL中只分离到1种cDNA序列，编码区长1 365 bp，命名为PL-APR2；在ZS11中共分离到2种差异cDNA序列，编码区长分别为1 371 bp和1 374 bp，对应命名为GL-APR2.1和GL-APR2.2。应用BioEdit 7.0对3条APR2推导氨基酸序列分析发现，它们之间的序列一致性为98.2%～99.1%，与AtAPR2的序列一致性为89.1%～89.9%；应用ChloroP 预测发现，PL-APR2、GL-APR2.1和GL-APR2.2的N端约60个氨基酸残基富含丝氨酸(S)，均具有典型的叶绿体转运肽剪切位点保守序列(VTRA)[24-25]；MOTIF Search分析也证明，来自油菜和拟南芥的APR2成熟肽拥有相同数量的功能结构域，均具有N端的PAPS_reduct结构域(46—226位)和C端的TRX结构域(295/296—385/386位)。且PL-APR2和GL-APR2.2序列在这2个核心结构域内氨基酸组成完全一致，说明它们的功能可能趋于一致。PL-APR2与GL-APR2.2的序列差异主要位于叶绿体转运肽序列，GL-APR2.2在第48—53位为2个连续的三氨基酸残基(SLK)重复，而PL-APR2在该位置缺失了1个SLK重复，该缺失位置处于叶绿体转运肽的转运功能区，暗示这2个前体蛋白的叶绿体跨膜转运效率可能存在差异[26-27]。GL-APR2.1与GL-APR2.2相比，两者在转运肽和PAPS_reduct结构域区无差异，但在成熟肽的第332位(TRX结构域区)存在V/I差异，GL-APR2.1与AtAPR2在该位点同为V。此外，GL-APR2.1在2个结构域间区还存在261(-/S)、278(N/S)和288(V/I)的结构差异，这些结构差异可能导致功能上的差异(图4)。综上所述，推测油菜来源的APR2与AtAPR2具有高度相似的生物学功能。

A:gDNA片段(引物组合APR2-F/APR2-R2);B:cDNA片段(引物组合APR2-F/APR2-R1);C:cDNA片段(1、3:引物组合APR2-F/APR2-R1;2、4:引物组合APR2-F/APR2-R2);M:DNA标准分子质量;1、2:XY-PL;3、4:ZS11A:gDNA fragment (Amplified with primers APR2-F and APR2-R2);B:cDNA fragment (Amplified with primers APR2-F and APR2-R1);C:cDNA fragment (Lane 1 and lane 3.amplified with primers APR2-F and APR2-R1;Lane 2 and lane 4.amplified with primers APR2-F and APR2-R2);M:DNA marker;1,2:XY-PL;3,4:ZS11图3 油菜APR2基因gDNA和cDNA序列PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of APR2 gDNA and cDNA fragments in rapeseed

—表示叶绿体转运肽序列;表示PAPS_reduct结构域区;表示TRX结构域区;*表示转运肽剪切位点;△表示催化活性中心—represents chloroplast transit peptide; represents PAPS_reduct domain; represents TRX domain；* represents cleavage site of chloroplast transit peptide；△represents catalytic active site图4 油菜与拟南芥APR2氨基酸序列比对结果 Fig.4 Alignment result of APR2 from rapeseed and Arabidopsis

以GL-APR2.2序列在NCBI网站进行BLASTp同源搜索，共获得163条高相似性的序列，剔除前100条中相同序列、PAPS还原酶及非命名为APR的序列，剩余78条序列，均来自于双子叶植物；另以“Adenosine 5′-phosphosulfate reductase”为关键词在该网站“Protein”子库中搜索，筛选获得了4条单子叶来源的APR序列。所有这些序列均来自植物APR蛋白的3种类型(APR1、APR2、APR3)，连同本研究克隆的3条APR2序列，采用MEGA-X 10.0进行了系统进化分析，并利用EvolView(https://www.evolgenius.info//evolview/)在线网站对进化树图进行了注释(图5)。

从图5可知，本研究克隆的3条APR2序列与拟南芥、油菜、萝卜、荠菜等十字花科的APR2处于同一进化分支，说明它们在进化上具有较近的亲缘关系；而单子叶来源的APR和双子叶来源的分处于同级平行进化分支[香樟(Cinnamomummicranthumf.kanehirae)例外]。图5还表明，不同物种的同种APR同工酶的进化亲缘关系比同一物种的不同APR同工酶间的亲缘关系更近。

2.3 拟南芥APR2转基因株系鉴定及叶色观察

对经潮霉素筛选后的T0代抗性苗PCR检测结果表明，共获得112株阳性转基因苗，其中PL-APR2转基因苗43株，GL-APR2.1转基因苗11株，GL-APR2.2转基因苗58株(图6)。

分单株收获上述T0代植株自交种子(T1、T2)，再将各株系T2代选取30～40颗种子进行潮霉素筛选。根据T2群体潮霉素抗性分离情况，分别获得各APR2转基因纯合株系(T1)为8(PL-APR2)、3(GL-APR2.1)、6(PL-APR2.2)个。对各转基因株系叶色观察发现，从T0—T2代油菜APR2转基因株系均未表现出紫叶表型，即使是T1代转基因纯合植株也未见紫叶表型，可能与转化受体材料Col-0存在野生型AtAPR2有关。进一步对转基因(PL-APR2)纯合植株与野生型植株叶片花青素含量进行比较，前者平均为0.022 3 mg/g，后者平均为0.024 8 mg/g，两者无显著差异。

M:100 bp DNA Ladder;P:阳性对照;N:阴性对照;1—112:APR2转基因植株M:100 bp DNA Ladder;P:Positive control;N:Negative control;1—112:APR2 transgenic plants图6 拟南芥转基因植株中油菜APR2基因的PCR检测Fig.6 PCR detection of APR2 originated from rapeseed in transgenic Arabidopsis lines

3 结论与讨论

3.1 APR基因结构

高等植物基因组中普遍存在3个APR同源基因，在功能上具有冗余性，其中APR2起主导作用，这种功能差异必定与其基因结构差异密不可分。APR前体蛋白是一种质体靶向蛋白，由转运肽和成熟肽两部分组成，其功能场所由转运肽序列决定。以拟南芥为例，3个APR同工酶均具有N端40～60个氨基酸的叶绿体转运肽序列，其序列一致性为28.6%～45.7%，远低于成熟肽之间的序列一致性(81.7%～94.5%)。这种转运肽序列的高变异性可能决定了其前体蛋白的跨膜转运效率，进而影响叶绿体内APR的总还原活性。其成熟肽均存在N端的PAPS_reduct结构域(181 aa)和C端的TRX结构域(93 aa)，且在相同位置具有极为保守的催化活性位点(CPFC)，说明各APR成员在功能上极为保守。但核心结构域内关键位点氨基酸的改变也可导致功能的巨大差异[13-14]。

本研究克隆的3条油菜APR2基因序列分离自紫叶和绿叶2种叶色材料，其中PL-APR2是唯一在紫叶材料中克隆到的，且该基因序列与紫叶材料6-1029中克隆的BnAPR2序列完全相同，同时还与白菜中APR2预测基因(XP_009123359)序列完全相同[17]；GL-APR2.2序列则与甘蓝型油菜BnaA03g59800D(GenBank中该基因被注释为5个外显子和4个内含子)序列完全相同，而GL-APR2.1在GenBank中没有搜索到完全相同的序列，可见其并非BnaC04g19270D转录本的加工产物，而是一个新发现的BnAPR2同源基因。但其相对于GL-APR2.2在第328位丝氨酸(S)的缺失，在甘蓝型油菜XP_013692449(C4)、甘蓝XP_013636863(C4)和萝卜XP_018458630中对应位置同样存在，其生物学效应未知。序列比较发现，3条油菜APR2 的PAPS_reduct结构域氨基酸序列完全相同，而在TRX结构域，GL-APR2.1和GL-APR2.2仅在成熟肽的第332位存在V/I的差异，缬氨酸(V)和异亮氨酸(I)为同类氨基酸，此种替换可能对其还原功能影响甚微；PL-APR2在TRX结构域与GL-APR2.2序列完全相同。在转运肽区，GL-APR2.1和GL-APR2.2的序列完全相同，而PL-APR2相对GL-APR2.2则在第51—53位缺失SLK 3个氨基酸残基。该缺失区位于叶绿体转运肽的C端，可能会影响蛋白质亲水性和亲脂性β折叠的形成，进而影响PL-APR2前体蛋白的跨膜转运效率[26-27]。进一步对SLK氨基酸残基结构分析发现，该结构仅存在于十字花科芸薹属(油菜、白菜、甘蓝、萝卜)、荠菜属(荠菜)及其姊妹科植物醉蝶花APR1和APR2蛋白的转运肽序列中，APR2通常存在1个或2个连续的SLK结构，APR1也存在1个或2个SLK结构，但2个SLK为非连续分布。

3.2 PL-APR2与紫叶表型

进一步分析发现，李海渤[17]的高表达数据来自对BnAPR2的定量和半定量分析结果，反映的是其转录水平，且BnAPR2的转录水平与6-1029及其近等基因系的叶片紫色深浅呈正相关。但APR还存在转录后水平的调控，转录水平升高但其酶活性却不一定改变，如在盐胁迫[12]或过表达MYB28[3]条件下，3个APR同源基因的转录水平均升高，但其总活性却不变，可见APR的表达调控极其复杂。本研究过表达PL-APR2未得到预期表型的主要原因在于转化受体材料中存在正常功能型AtAPR2，可能对PL-APR2的叶色表型效应产生了干扰。

甘蓝型油菜硫缺乏会导致花色苷含量显著增加[15]。因此，油菜XY-PL的紫叶表型可结合拟南芥的研究成果进行如下推论。拟南芥是一种低需硫植物，APR1或APR2功能缺失均不会影响其正常生长发育，而油菜是一种高需硫作物，其APR2异常极有可能造成生理性硫缺乏，从而造成次级代谢产物GSH合成量的不足，导致胞内活性氧等有害物质积累[28]；GSH不足的信号将通过调控回路促使APR2高水平转录，可能通过转录因子HY5的直接调控实现[29]，而HY5也是花色苷合成结构基因CHS、CHI、F3H和DFR表达的正向调控因子[30]；在低温和光照等环境因子共同作用下，最终出现APR2高水平转录的同时，花青素也大量合成，叶片呈现紫色。花青素也是一种高效的活性氧清除剂，可以解除因GSH不足导致的胞内氧化胁迫，保障细胞生理活动的正常进行。该推论能够较好地解释6-1029和XY-PL紫叶表型的形成，也与李海渤[17]对近等基因系紫叶(PL)、浅紫叶(PPL)、绿叶(GL)植株中BnAPR2表达水平(PL>PPL>GL)的分析结果相符。近等基因系绿叶(GL)表型的形成，可能是因为甘蓝型油菜基因组中其他功能正常的APR2同源基因(如BnaC04g19270D)被激活，进而取代了PL-APR2的功能缺失。从紫叶油菜XY-PL的表型观察结果来看，基因组中PL-APR2的存在是紫叶表型的必备前提。初步试验结果发现，XY-PL的紫叶表型明显受温度影响，13 ℃是其紫叶表型临界温度，高于此温度则幼苗真叶表现绿色。25 ℃培养条件下，幼苗紫色叶片颜色会随时间逐渐减褪，新生叶为绿色。

因此，PL-APR2因其叶绿体转运肽转运功能区SLK氨基酸残基的缺失，可能导致其前体蛋白不能或低效进行跨膜转运，成为了上述推论正确与否的关键点，下一步将采用亚细胞定位技术，对PL-APR2和GL-APR2的转运肽转运功能与效率进行比较研究。同时，还将采用拟南芥apr2突变体进行再次遗传转化，为上述推论提供充分证据。

本研究采用同源克隆法，从紫叶油菜XY-PL和绿叶油菜中双11号中共分离获得3条APR2同源基因序列(PL-APR2、GL-APR2.1和GL-APR2.2)，其均由4个外显子和3个内含子组成，其编码产物均具有典型的叶绿体转运肽序列，序列之间的一致性为98.2%～99.1%，在系统进化关系上与十字花科植物来源的APR2亲缘关系最近。在蛋白质结构上，3个APR2蛋白成熟肽核心结构域序列高度一致，但PL-APR2在叶绿体转运肽转运功能区存在3个氨基酸残基(51SLK53)缺失，可能会影响其前体蛋白的跨膜转运。在野生型拟南芥中过表达PL-APR2，转基因株系在T0—T2代均未表现出紫叶表型，可能与转化受体材料内存在野生型AtAPR2有关。