淡竹叶黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究

王紫薇，涂明锋，叶文峰*， 彭 靖

(1.宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000；2.宜春市人民医院Ⅰ期临床研究室，江西 宜春 336000)

淡竹叶为禾本科植物淡竹叶(Lophatherum gracile Brongn)的干燥茎叶，含有三萜类、黄酮类、酚性成分、多糖类等化合物，其中以黄酮类为主，现代药理学研究表明，淡竹叶具有抑菌、抗氧化、抗病毒、调节血脂、抗肿瘤、解热利尿、调节血糖等作用[1-5]。淡竹叶在临床上应用较为广泛，已开发成像小儿退热口服液、口炎片、复方西羚解毒丸等制剂，淡竹叶所含有的黄酮类等化合物，在具有抗氧化、延缓衰老等功效的保健食品开发上也有着十分巨大的应用前景[6]。

实验采用超声波辅助提取淡竹叶中黄酮类化合物，通过响应面软件对实验选取的乙醇浓度、提取时间、超声功率等主要影响因素单一作用及交互作用进行更深入的研究，从而得出最佳提取工艺条件，并对淡竹叶黄酮的抗氧化性能进行研究，为淡竹叶的开发应用提供理论依据[7-8]。

1 实验材料与仪器

淡竹叶(购于宜春市神农堂大药房)，芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司)，亚硝酸钠、硝酸铝(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇、95%乙醇、30%H2O2、FeSO4、水杨酸、Tris-Hcl缓冲液、邻苯三酚(均购于国药集团化学试剂有限公司)，DPPH(阿拉丁试剂有限公司)，以上试剂均为分析纯。

BS223S天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；752N紫外可见分光光度计(上海佑科仪器有限公司)；SK8210LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 黄酮含量测定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量，以芦丁为标准品，参照文献[9-10]，并稍作修改。在510nm处测得标准曲线回归方程为：Y=0.0095X-0.0317，R2=0.9964。然后测定黄酮提取液的吸光度，代入标准曲线方程得到待测液中样品浓度，再根据提取率公式求出淡竹叶黄酮的提取率，提取率公式如下：

式中:C为黄酮浓度,mg/mL;V为样品溶液体积,mL;N为稀释倍数;m为淡竹叶粉末质量,g。

2.2 单因素实验

以黄酮提取率为评价指标，探究乙醇浓度(45%、55%、65%、75%、85%)、提取时间(5min、15min、25min、35min、45min)、超声功率(200W、250W、300W、350W、400W)对淡竹叶中黄酮提取率的影响。

2.3 响应面实验设计

依据单因素实验结果，进行响应面实验设计，对黄酮提取工艺条件进行优化。因素与水平如表1所示。

表1 响应面实验因素与水平设计

2.4 淡竹叶黄酮抗氧化性研究

2.4.1 淡竹叶黄酮对超氧阴离子的清除作用[11]

配制不同浓度的淡竹叶黄酮溶液，取1.0mL不同质量浓度的样品溶液于比色管中，分别加入4mL Tris-Hcl缓冲液，25℃水浴加热20min，分别加入0.3mL 5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀，于420nm处检测各组吸光值，空白对照组用相同体积的蒸馏水替代样品，按如下公式进行计算：

式中：A0为空白对照组吸光度；Ax为样品组吸光度。

2.4.2 淡竹叶黄酮对羟自由基的清除作用[12]

取1.0mL不同质量浓度的样品溶液于比色管中，分别加入3mL 7.5mmol/L水杨酸-乙醇溶液、3mL磷酸盐缓冲液(pH值=7.4)、2mL 0.75mmol/L FeSO4以及2mL 0.01%双氧水，混匀，37℃水浴30min，于510nm处测吸光值。计算公式如下：

2.4.3 淡竹叶黄酮对DPPH的清除作用[13]

取1.0mL不同质量浓度的样品溶液于比色管中，分别加入4mL 0.1mmol/LDPPH溶液，混匀，放置在暗处反应30min，于517nm处测定吸光度值。计算公式如下：

式中：Ax为不同样品溶液吸光度值；Axo为1mL样品+4mL乙醇吸光度值；Ao为1mL乙醇+4mLDPPH吸光度值。

3 实验结果与讨论

3.1 单因素实验结果与讨论

3.1.1 乙醇浓度对淡竹叶黄酮提取率的影响

乙醇浓度对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

由图1可看出，不同浓度的乙醇溶液作溶剂，黄酮提取率有所不同，乙醇浓度<65%时，黄酮提取率随着乙醇浓度的增大而升高，乙醇浓度>65%时，黄酮提取率随着乙醇浓度的增大而降低，由此可以确定乙醇的最佳浓度为65%。

3.1.2 提取时间对淡竹叶黄酮提取率的影响

提取时间对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图2所示。

图2 提取时间对黄酮提取率的影响

由图2可看出，所用的提取时间不同，竹叶黄酮的提取率也有所不同，当提取时间处于5～25min区间时，黄酮提取率随着提取时间的增加而升高；当提取时间处于25～45区间时，黄酮提取率随着提取时间的增加而降低，表明25min应为最佳提取时间。

3.1.3 超声功率对淡竹叶黄酮提取率的影响

超声功率对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图3所示。

图3 超声功率对黄酮提取率的影响

由图3可看出，超声功率不同，淡竹叶黄酮提取率也有所不同，当提取功率处于200～300W区间时，黄酮提取率随着提取功率的增大而升高；当提取功率处于300～400W区间时，黄酮提取率随着提取功率的增大而降低，表明300W为最佳超声功率。

3.2 响应面实验结果及分析

3.2.1 响应面实验结果

根据2.3设计的因素水平，采用Box-Beknhen实验设计原理进行实验设计，并对每组方案进行试验，得出相应的黄酮提取率，设计及结果如表2。

表2 响应面法设计与试验结果

表2(续)

3.2.2 建立模型方程与显著性检验

根据表2中实验数据进行多项拟合回归分析，得到淡竹叶黄酮提取率(Y)对乙醇浓度(A)、提取时间(B)、超声功率(C)的二次多项回归模型方程：

Y=2.09+0.07A+0.089B+0.036C-0.085AB-0.02AC-0.058BC-0.08A2-0. 14B2-0.093C2

表3 响应面二次回归方程方差及显著性分析

注：*表示P<0.05，显著差异；**表示P<0.01，极显著差异；-表示P>0.05，差异不显著。

二次多项回归方程方差及显著性分析见表3，该模型的P<0.0001，表明二次多项式模型整体上比较显著，失拟项检验的P=0.1248>0.05，表明失拟项检验不显著，方程的相关系数R2=0.9607，可知该方程对实验拟合较好，可以对实验进行预测。一次项A、B、AB和BC的交互项及A2、B2和C2二次项对黄酮提取率均具有极显著差异；一次项C对黄酮提取率具有显著差异；AC交互项对黄酮提取率不具有显著性影响，各因素对多糖得率影响大小依次为B>A>C，即超声时间 > 乙醇浓度 > 超声功率。

3.2.3 响应面分析

利用Design-Expert软件对各因素间交互作用进行分析，得到响应面图以及等高线图，结果见图4至图6。

图4 乙醇浓度与提取时间对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)

图5 乙醇浓度与超声功率对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)

图6 提取时间与超声功率对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)

双曲面坡度平缓表示2个因素交互作用不显著，坡度陡峭表示2个因素交互作用显著；等高线的密集程度和形状可反映出交互效应的强度大小，等高线越密集，说明二者交互作用越显著；椭圆形表示2个因素交互作用显著，圆形则表示2个因素的交互作用不显著。图4～图6中，图4与图6中等高线图近似椭圆，倾斜度相对图5更高，表明两张图片所对应的交互因素的交互作用明显，图5中等高线图近似圆形，则表明该图片中的交互因素交互作用不明显。

3.2.4 最佳工艺条件的确定与验证试验

通过响应面软件可以得出，试验最佳工艺参数为乙醇浓度68.15%，提取时间27.04min，超声功率304.91W，该条件下淡竹叶黄酮提取率为2.11%，为了试验操作的可行性与便利性，将工艺条件调整为乙醇浓度68%，提取时间27min，超声功率305W。采用最佳工艺条件提取淡竹叶黄酮3次，进行验证性实验，三次试验中淡竹叶黄酮提取率平均值为2.08%，与理论值2.11%相近，表明采用响应面法优化得到的最佳工艺条件准确，具有一定的可行性。

3.3 淡竹叶黄酮抗氧化性能试验结果

淡竹叶黄酮对O2-、·OH、DPPH的清除作用结果见图7。

图7 黄酮抗氧化性能结果图

由图7可知，淡竹叶黄酮对这三种自由基具有一定的清除作用，并且清除效果随着淡竹叶黄酮质量浓度的增大而增强，但清除能力均比VC弱。当淡竹叶黄酮为0.5mg/mL时，对O2-·、·OH、DPPH·清除率分别为40.2%，73.0%，34.4%，表明在相同质量浓度下，淡竹叶黄酮对·OH的清除效果最好。

4 结论

通过单因素试验和响应面优化得到淡竹叶黄酮提取最优条件为乙醇浓度69%，提取时间27min，超声功率304W。

淡竹叶黄酮对DPPH、O2-、·OH自由基具有一定的清除效果，并且清除效果随着淡竹叶黄酮质量浓度的增加而增强，IC50分别为1.12mg/mL、0.82 mg/mL、0.19 mg/mL。