南方根结线虫侵染下罗汉果代谢组学研究

李璐璐，韦文琼，程 颖，李佳慧，李惠敏

(1. 广西师范大学 生命科学学院，桂林 541006; 2. 广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室, 桂林 541006 )

南方根结线虫(Meloidogyneincognita)是一类侵染大多数栽培植物的内寄生线虫之一，罗汉果(Siraitiagrosvenorii)为广西特有经济作物，其主栽品种也易受南方根结线虫的侵害，而且患病状态下的植株更易遭受真菌或细菌的混合侵害而引起根系或薯块腐烂,进而加速病株死亡[1-2]。

南方根结线虫以其侵染性二龄幼虫侵入寄主植物根系，通过干扰细胞正常的生长发育，形成维持线虫取食的巨细胞以及根结[3]。目前，对植物寄生线虫如根结线虫、孢囊线虫等的致病分子生物学机制研究取得了显著的进展, 普遍认为线虫口针和食道腺分泌物是植物线虫致病相关物质的重要组成部分，分泌型蛋白在侵染及建立寄生关系中也起着重要作用，而寄主植物在线虫侵入、转移、刺激巨细胞形成中也发生了一系列复杂的变化[4]。

植物代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在揭示生命基本活动及规律中将发生越来越重要的作用[5]。当植物生长环境发生变化(非生物胁迫、病虫害等)，植物自身会通过表型、生理生化等一系列的变化来进行自我调节以适应这些逆境，植物在自我调节以适应这些环境的过程中，其代谢物同样扮演着非常重要的角色。

鉴于目前对于罗汉果植株根系受根结线虫侵染早期其代谢变化情况知之甚少，本研究对罗汉果幼苗进行人工接种南方根结线虫后，拟采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术，对罗汉果幼苗根系进行代谢轮廓变化非靶向分析，旨在为揭示罗汉果植株与南方根结线虫早期互作分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料的处理与收集

本研究以罗汉果幼苗为植物材料，参照刘纪霜[2]和焦春伟等[6]方法，待盆栽幼苗已长出4～6片功能叶时采用人工接种南方根结线虫的方法进行侵染其幼根：二龄幼虫接种量为1000条/株，以无菌水接种作为对照，重复实验3次即为处理组和对照组各3个生物学重复。人工接种南方根结线虫后7 d，从每一批次的实验组和对照组各选取生长状态比较相似的罗汉果植株，自来水清洗掉根部沙土，蒸馏水清洗干净后用吸水纸吸干表面水分，再用解剖刀将带根结的侧根切下，同时收集对照组植株相似部位的侧根，称取样品，按1 g/份进行分装，标记后迅速用液氮处理，-80 ℃保存以备提取代谢产物所用。

1.2 代谢组学分析

1.2.1 LC-MS分析

根系样本委托上海派森诺生物技术公司进行代谢物的甲醇/乙腈/水溶液(4∶4∶2)提取及采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC 色谱柱进行分离，样品经UHPLC 分离后采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式用Triple TOF 6600 质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。

1.2.2 数据处理及模型识别分析

代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<10 ppm)和二级谱图匹配的方式，检索生物技术公司实验室自建数据库。原始数据中，缺失值超过50%的代谢物将被去除，不参与后续分析；对数据进行总峰面积归一化，并在SIMCA-P 软件中对数据进行Pareto-scaling 处理。对预处理后的数据进行无监督主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal to partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。

1.2.3 差异代谢物筛选

通过变异倍数分析(Fold change analysis，FC analysis)t检验单变量分析法，筛选南方根结线虫侵染下出现差异累积的罗汉果根系代谢物，以FC>2.0 且P<0.05 作为差异显著代谢物的筛选标准。

2 结果与讨论

2.1 罗汉果幼苗被南方根结线虫侵染后根系情况

植物根结线虫病的典型症状是在寄主植物的根部形成根结，在不同根结线虫-寄主植物互作体系中，从根结线虫2龄幼虫侵入到诱导植物产生巨型细胞的时间长短不一[3]。对罗汉果幼苗进行人工接种南方根结线虫，最早发现根结是在接种4 d后。图1-c、d显示了接种后7 d取样时在罗汉果幼苗的侧根根尖部位可见根结的情况，而侧根的其他部位和主根未发现根结；图1-a、b为未接种南方根结线虫的对照苗，无根结。

b和d分别对应于a和c中方框部分通过拖放鼠标进行放大，箭头所示为侧根上形成的小根结

b and d show local box amplification by pulling the mouse in a and c respectively. The arrows indicating galls of lateral roots

图1对照(a)和处理(c)罗汉果根系比较

Figure 1 Comparing control(a)and treatment roots ofSiraitiagrosvenorii

2.2 南方根结线虫侵染下罗汉果根系LC-MS分析结果

通过对LC-MS 数据分析，共检索出221种化合物，主要为可溶性糖类、氨基酸、有机酸等。SIMCA-P 14.1(Umeitrics，Umea，Sweden) 分析得到罗汉果幼苗根在南方根结线虫侵染早期，其代谢物的PCA和OPLS-DA结果分值图，接种南方根结线虫的处理组和对照组样品呈现明显分离(图 2和图 3)，这说明接种南方根结线虫7 d后，罗汉果根系代谢物出现了整体变化。

2.3 南方根结线虫侵染对罗汉果根系代谢物累积的影响

2.3.1 南方根结线虫侵染下罗汉果根系代谢物的变化

C和T分别表示对照组和处理组，下同

C and T show control and treatment respectively，the same as follow

图2罗汉果根系代谢物PCA分图

Figure 2 PCA analysis of metabolites ofSiraitiagrosvenoriiunder infection ofM.incognita

图3 罗汉果代谢物正、负离子模式OPLS-DA得分图

南方根结线虫侵染早期，罗汉果植株根系代谢物的累积发生了较大的变化，表 1列出了单变量统计分析筛选差异2倍以上的代谢物，这些代谢物主要包括可溶性糖、三羧酸循环中间代谢物、核苷酸、氨基酸、维生素等。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解途径和磷酸戊糖途径共有的中间代谢物，在南方根结线虫侵染后罗汉果根系中出现了明显累积的现象，嘌呤代谢中间产物尿囊酸和尿囊素也出现了大量累积的现象，但这些差异变化并不显著(P>0.05)。本研究中只检测到16种代谢物的含量在南方根结线虫侵染早期发生了显著性差异变化(P<0.05)。其中植物细胞壁的降解产物纤维二糖和具有保护生物大分子功能的海藻糖均出现显著性降低；与木质素形成有关的肉桂酸类衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯也出现了显著性降低。而涉及脂类代谢的二乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、十四烷酸、十六烷酸均出现了显著性积累。氨基酸类既有上升积累的情况，也有减少的情况，其中带羟基基团的氨基酸如羟基精氨酸、酪氨酸和苏氨酸出现了不同程度降低的现象，然而差异并不显著。作为辅酶或者辅基的组成成分参与体内物质代谢过程的B族维生素：硫胺素(维生素B1)、核黄素(B2)、吡哆醇(维生素B6)也发生了含量非限制性增加或减少的变化；而作为多种脱氢酶辅酶的烟酰胺(维生素PP)则出现显著性累积的现象。

2.3.2 南方根结线虫侵染对罗汉果根系代谢物累积的影响

根结线虫侵染植株后,线虫口针和食道腺分泌物在寄主植株体内释放，从而影响其根系的物质代谢和一系列生理生化反应,根系中各种化学物质特别是内源激素发生不同程度的变化[7-10]。本研究结果发现，感染根结线虫的罗汉果根系生长素的含量相比于未感染根的生长素含量略有减少(为对照的0.93倍)，但脱落酸却出现显著性减少的现象；刘亚丽[8]也发现接种根结线虫的小黑豆根结部位脱落酸含量与对照相比，接种前期显著低于对照；而郭衍银等[9]则发现南方根结线虫侵染可使生姜根茎中吲哚乙酸含量显著降低,脱落酸则表现为前期降低,后期增加的趋势。

表 1 南方根结线虫侵染下罗汉果根系差异代谢物

注：字母a和b分别表示该数值在P<0.05和P<0.01水平上显著差异

Note: letter a and b fouowed the data respresent signiticant difference at the 0.05 and 0.01 level, respectively

木质素作为植物细胞壁的基本组成成分,对病原的侵害起到屏障作用,植物在被接种病原体后,木质素含量会有显著变化,并且免疫反应中的信号分子含量、抗病基因表达水平也与木质素有相互关系[10]。在环境胁迫条件下，植物可以通过增加木质素的积累使线虫难以建立侵染位点，从而降低线虫危害。尤杨等[11]的研究结果表明，活性氧和木质素的大量积累是荧光假单胞菌Sneb825诱导番茄抑制南方根结线虫侵染的防御对策之一;徐小明等[12]的研究结果表明，遭受南方根结线虫侵染后茄子砧木幼苗根系出现不同程度的木质素积累，但高抗根结线虫品种托鲁巴姆的木质素含量显著高于感病品种赤茄。贾双双等[13]研究南方根结线虫侵染对2个不同抗性番茄砧木幼苗根系的苯丙烷类代谢的影响，其结果也表明木质素积累量均在接种线虫7 d内迅速升高，且抗性品种‘坂砧2号’明显高于感病品种‘Ls-89’。本研究结果表明与木质素单体形成有关的肉桂酸类衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯均出现了显著性降低。鉴于本研究结果中苯丙氨酸虽然出现了2倍多的积累，但并非显著性水平差异，是否意味着由苯丙氨酸代谢生成肉桂酸的过程并未发生显著性变化，而肉桂酸类衍生物显著性降低则是大量合成了木质素所致？这可为下一步联合转录组等研究提供思路。

值得注意的是，本研究中发现南方根结线虫侵染下的罗汉果根系累积了大量的酰脲(尿囊酸和尿囊素)，其中尿囊酸与未接种南方根结线虫的对照组相比更是高达9倍多。在高等植物中,尿囊酸和尿囊素是嘌呤降解途径上的两种中间产物,不仅是氮素转运和存储过程中的重要物质,而且已有研究表明尿囊素在植物抗逆应答过程中也发挥着重要作用[14]。Coleto等[15]对比耐旱性不同的菜豆品系发现,干旱胁迫下,各品系植株均发生酰脲类化合物积累,虽然干旱敏感品系中存在更高的酰脲水平,但所积累的酰脲多为尿囊酸,而抗旱品系所积累的酰脲中,尿囊素比例较高。因此，在南方根结线虫侵染下的罗汉果根系积累的酰脲主要为尿囊酸而非尿囊素，这可能与罗汉果为南方根结线虫敏感品系而非抗性品系有关；也有可能在线虫侵染下，罗汉果根系中尿囊酸酶的活性发生了较大变化，导致尿囊酸没能进一步分解生成尿素或NH3和CO2，结论有待进一步的研究考证。有研究[16-18]结果表明在植物寄生线虫的取食点细胞中发现葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸含量显著上升，本研究也发现受到南方根结线虫侵染后罗汉果根系出现葡萄糖-6-磷酸累积现象。磷酸戊糖途径是植物体中葡萄糖代谢的重要途径，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是该途径的关键性调控酶，催化第一步不可逆的葡萄糖-6-磷酸氧化反应并严格控制着该途径的代谢速率。Hu等[18]研究结果表明功能缺失拟南芥突变体的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性显著降低，和野生型相比，该突变体对根结线虫的敏感性却显著增加。罗汉果植株对南方根结线虫的侵染比较敏感[1]，是否意味着这很有可能与其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的表达情况密切相关？该结论有待今后通过深入研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在南方根结线虫与罗汉果植物互作中的生物学功能及其调控机制进行验证。

3 结论

受到南方根结线虫侵染的前期，罗汉果植株根结内累积了大量的葡萄糖-6磷酸、酰脲(尿囊酸和尿囊素)；而与木质素形成相关的肉桂酸类衍生物迷迭香酸、香草酸、肉桂酸甲酯则显著性减少；其他包括可溶性糖、维生素、游离氨基酸等多种物质含量也发生了变化。本研究结果可为今后研究罗汉果与南方根结线虫之间相互作用的分子机制提供参考。