不同采收期赤芍中6种有效成分的含量测定及其变化规律研究

付士朋 沈宏伟 王谦博 李俊萍 王聪 郭盛磊 王振月

摘 要 目的：建立同时测定不同采收期赤芍中6种有效成分含量的方法，并探讨其变化规律，以确定最佳采收期。方法：采用高效液相色谱法测定样品中没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷的含量并进行主成分分析。色谱柱为Thermo C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 ?L。结果：上述6种成分的质量浓度线性范围分别为0.013 2～0.25 mg/mL（r=0.999 2）、0.013 2～0.25 mg/mL（r=0.999 9）、0.026 8～0.51 mg/mL（r=0.999 7）、0.42～8.01 mg/mL（r=0.999 2）、0.016～0.31 mg/mL（r=0.999 4）、0.02～0.38 mg/mL（r=0.999 8）;定量限分别为0.009 3、0.008 5、0.016 3、0.021 7、0.011 3、0.017 4 mg/mL，检测限分别为0.003 3、0.002 7、0.005 4、0.007 3、0.003 8、0.005 9 mg/mL;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%;加样回收率为 96.01%～99.43%（RSD=1.23%，n=9）、97.95%～100.45%（RSD=0.79%，n=9）、97.98%～100.11%（RSD=0.68%，n=9）、98.83%～100.09%（RSD=0.65%，n=9）、98.58%～100.95%（RSD=1.35%，n=9）、96.28%～103.26%（RSD=1.76%，n=9）。赤芍药材（根）中上述6种成分的含量分別为0.016%～0.057%、0～0.067%、0.207%～0.640%、2.350%～5.887%、0.030%～0.245%、0.054%～0.381%。5月30日采收的赤芍药材折干率最低（约33%），9月15日折干率最高（约49%）。7-10月采收的赤芍叶中没食子酸、芍药内酯苷的含量均高于根部。主成分分析结果显示，前2个主成分的方差贡献率分别为71.845%、18.170%，累积方差贡献率为90.015%;综合得分较高的月份为5-6月、9-10月。结论：所建含量测定方法简便、准确，重复性、精密度较好，可用于测定不同采收期赤芍药材中6种有效成分的含量测定;赤芍药材的最佳采收期为9月30日-10月15日，叶可在7月15日前后采收。

关键词 赤芍;根;叶;采收期;高效液相色谱法;含量测定;变化规律;主成分分析

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 6 active ingredients in Paeonia lactiflora during different harvest periods， and to investigate its variation rules so as to determine the optimal harvesting period. METHODS： HPLC method was adopted to determine the contents of gallic acid， catechin， alibiflorin， paeoniflorin， benzoic acid and benzoylpaeoniflorin， and principal component analysis was conducted. The determination was performed on Thermo C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 ?L. RESULTS： The linear range of the above 6 ingredients were 0.013 2-0.25 mg/mL（r=0.999 2）， 0.013 2-0.25 mg/mL （r=0.999 9）， 0.026 8-0.51 mg/mL（r=0.999 7）， 0.42-8.01 mg/mL（r=0.999 2）， 0.016-0.31 mg/mL （r=0.999 4）， 0.02-0.38 mg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantification were 0.009 3， 0.008 5， 0.016 3， 0.021 7， 0.011 3， 0.017 4 mg/mL， and the limits of detection were 0.003 3， 0.002 7， 0.005 4， 0.007 3， 0.003 8， 0.005 9 mg/mL. RSDs of precision， stability and repeatability tests were less than 2%. The recoveries were 96.01%-99.43% （RSD=1.23%， n=9）， 97.95%-100.45% （RSD=0.79%， n=9）， 97.98%-100.11% （RSD=0.68%， n=9）， 98.83%-100.09% （RSD=0.65%， n=9）， 98.58%-  100.95% （RSD=1.35%， n=9）， 96.28%-103.26% （RSD=1.76%， n=9）. The contents of above 6 ingredients in Radix Paeoniae Rubra （roots） were 0.016%-0.057%， 0-0.067%，0.207%-0.640%， 2.350%-5.887%， 0.030%- 0.245%，0.054%-

0.381%， respectively. On May 30th， the drying rate of Radix Paeoniae Rubra was the lowest （about 33%）， and on Sept. 15th， the drying rate was the highest （about 49%）. The contents of gallic acid and paeoniflorin in the leaves of P. lactiflora were higher than the root during Jul.-Oct. Results of principal component analysis showed that the variance contribution rates of the first two principal components were 71.845% and 18.170%， respectively; cumulative variance contribution rate was 90.015%. The months with higher comprehensive scores were May to Jun. and Sept. to Oct.  CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate， reproducible and precise. It can be used to determine the contents of 6 active ingredients in Radix Paeoniae Rubra during different harvest periods. Sept. 30th to Oct. 15th is the optimum harvesting  periods for Radix Paeoniae Rubra， and leaves can be harvested around Jul. 15th.

KEYWORDS   Paeonia lactiflora; Roots; Leaves; Harvesting period; HPLC; Content determination; Variation rule; Principal component analysis

赤芍为毛茛科芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia vitchii Lynch）的干燥根，具有清热凉血、散淤止痛的功效[1]。该药始载于《神农本草经》，被列为中品[2]，其药理活性成分主要包括酚酸类、单帖苷类及苯肽类成分[2-3]。現代研究表明，该药具有调节免疫、解痉挛、抗炎、抗惊厥、改善心肺功能、抑制癌细胞增殖等作用[4-6]。目前，有关赤芍的研究主要集中在药理作用、化学成分提取与分离等方面[7-8]，而对其最佳采收期的研究较少，仅有2015年版《中国药典》（一部）中规定赤芍可在春秋二季采挖[1]。

同一地区药材因采收时间不同，其有效成分的含量也会存在差异，这对药材的质量有较大的影响，因此可通过有效成分含量的高低来确定最佳采收期[9]，以确保药材质量。本课题组在研究刺五加时发现，其叶中所含成分与根中基本一致[10-11]，提示中药不同部位的成分可能相似;同时，目前关于赤芍叶中有效成分的研究较少。为此，本研究从开发药材新的药用部位、避免资源浪费的角度出发，在探讨同一年不同月份内赤芍化学成分是否存在规律性变化的同时，比较了其根与叶中有效成分含量的动态变化规律，以确定赤芍的最佳采收期，旨在为其规范化种植与采收提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerTM 3色谱工作站（美国Waters公司）;FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;AE240型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];H1650型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）;KM-822C型超声波清洗机（广州市科洁盟实验仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

没食子酸对照品（批号：Y19M8C36143，纯度：≥98%）、儿茶素对照品（批号：Y89W8F4653，纯度：≥98%）、芍药内酯苷对照品（批号：Y25F8H30152，纯度：≥98%）、芍药苷对照品（批号：X12A8C33672，纯度：≥98%）、苯甲酸对照品（批号：Z18S7H21155，纯度：≥98%）、苯甲酰芍药苷对照品（批号：P02D7F26004，纯度：≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司;乙腈为色谱纯，甲醇等其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.3 药材

11批赤芍样品（编号：S1～S11;其中，赤芍根以“赤芍药材”表示，叶以“赤芍叶”表示）均采集于黑龙江中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为毛茛科芍药（P. lactiflora Pall.）的干燥根或叶，样品信息来源见表1。赤芍药材采集后立即洗去泥沙，称定鲜质量，于40 ℃烘干，称定干质量。赤芍药材和赤芍叶粉碎后过40目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，5%A→9%A;8～20 min，9%A→10%A;20～24 min，10%A→13%A;24～28 min，13%A;28～38 min，13%A→16%A;38～48 min，16%A→23%A;48～52 min，23%A→30%A;52～70 min，30%A→70%A）;流速：1.0 mL/min;检测波长：230 nm;柱温：35 ℃;进样量：10 ?L。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷对照品适量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成含上述6种成分质量浓度分别为0.25、0.25、0.51、8.01、0.31、0.38 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取赤芍药材或赤芍叶粉末1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加80%甲醇10 mL，称定质量，超声（功率：480 W，频率：40 kHz）提取45 min，再次称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，以4 000 r/min离心3 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 以80%甲醇为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液（编号：S1）、阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果，理论板数按芍药苷峰计不低于3 000，阴性对照无干扰，各成分分离度均大于3，详见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，制成不同质量浓度的系列线性工作溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

2.5 定量限与检测限考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷的定量限分别为0.009 3、0.008 5、0.016 3、0.021 7、0.011 3、0.017 4 mg/mL，检测限分别为0.003 3、0.002 7、0.005 4、0.007 3、0.003 8、0.005 9 mg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷峰面积的RSD分别为0.63%、0.65%、0.38%、0.54%、0.83%、0.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S1）适量，分别于室温放置0、2、4、8、12 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷峰面积的RSD分别为0.63%、0.76%、0.53%、0.66%、0.71%、0.65%（n=5），表明供试品溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取赤芍药材粉末（编号：S1）1 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中6种成分的含量。结果，没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷含量的RSD分别为1.13%、1.11%、1.22%、1.34%、1.28%、1.34%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的赤芍药材粉末（编号：S1）1 g，共6份，分别按各已知含量的50%、100%、150%比例加入各单一对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果表明，本方法准确度良好，详见表3。

2.10 赤芍药材样品含量测定

取11批赤芍药材粉末各1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中6种成分的含量。每样品平行测定3次，取平均值，结果见表4。

2.11 不同采收期赤芍药材折干率的动态变化

计算不同采收期赤芍药材的折干率：折干率=（干质量/鲜质量）×100%。折干率越高表示药材所含水份越少[12]。以采收期（x）为横坐标、折干率（y，%）为纵坐标绘制折干率动态变化柱状图，结果见图2。由图2可知，不同采收期赤芍药材的折干率存在差异，其中5-10月采收的赤芍药材折干率总体呈上升趋势;8月30日-10月15日折干率均大于48%，并在9月15日达到最高值，约为49%;5-6月折干率较低，在5月30日达最低，约为33%。

2.12 不同采收期赤芍药材中有效成分的动态变化

以采收期（x）为横坐标、有效成分含量（y，%）为纵坐标，绘制有效成分含量动态变化折线图，结果见图3、图4（因芍药苷含量过大，约为其他成分的10倍，在图中会影响整体视图效果，故将芍药苷含量缩小10倍，缩小后不影响含量变化趋势。由于芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍藥苷的含量变化趋势相似，且儿茶素、没食子酸含量较低，所以6种成分无法在同一图中展示，故分别作图分析）。

从图3可知，5-10月采收的赤芍中芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷含量波动幅度较大，总体呈现下降趋势。5月15日采收的赤芍药材中芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷含量均为最高，分别为0.640%、5.887%、0.381%;10月30日采收的赤芍药材中芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷含量最低，分别为0.207%、0.054%;芍药苷在9月15日时为最低值，为2.350%。8-10月含量波动幅度较5-7月平缓;10月30日采收的赤芍药材中的3 种成分均又出现下降趋势，苯甲酰芍药苷含量下降明显。

从图4可知，5-10月采收的赤芍药材中没食子酸含量波动幅度较小，儿茶素、苯甲酸含量波动幅度相对较大。5月15日采收的赤芍药材中没食子酸、儿茶素含量均为最高，分别为0.057%、0.067%;但7月15日-8月30日采收的赤芍药材中未检测到儿茶素;7月30日采收的赤芍药材中苯甲酸含量最高，为0.245%。