雌激素对老年C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的影响*

陈 龙 ， 杨玉琪， 冯子奕， 李雪蕊， 韩子伟， 马克涛， 司军强， 李 丽

(1. 石河子大学医学院生理教研室， 新疆 石河子832002； 2. 新疆军区总医院第951医院， 新疆 库尔勒 841000； 3. 嘉兴学院医学院， 浙江 嘉兴 314000； 4. 中国人民解放军69340部队， 新疆 阿勒泰 836100)

老年性耳聋(presbyacusia)，又称年龄相关性听力损失(age-related hearing loss,AHL)，是指耳蜗听觉功能随年龄增长而下降，同时伴有感觉毛细胞、螺旋神经节细胞缺失等[1]。耳蜗螺旋神经节是听觉传导通路中的第一级神经元，螺旋神经节神经元发生年龄相关性退化是AHL外周神经系统发生发展的主要原因[2]。雌激素是一种类固醇类性激素，研究表明，雌激素对听力有一定的保护作用[3, 4]，雌激素替代治疗，可减少女性围绝经期的听力损失[5]，提示雌激素可减缓听力下降，但其机制尚不明确。本实验以老年C57BL/6J小鼠为AHL模型，分别施行卵巢去除术，外源性雌激素替代，观察AHL中雌激素对于螺旋神经节神经元缺失及细胞凋亡的影响，来探讨雌激素对AHL的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验动物由北京维通利华动物中心提供，选取无耳疾C57BL/6J雌性小鼠40只，体重25～35 g,按不同年龄分为：3月龄(3 m)组10只，12月龄(12 m)组30只。将12月龄组再根据干预措施随机分成3组,每组10只：12 m组为12月假手术组；12 m OVX 组(12月去卵巢组)在9月龄行双侧卵巢切除术，正常饲养至12月龄；12 m OVX+E2组(雌激素干预组)在9月龄行双侧卵巢切除术，经过1月洗脱期后，给予皮下注射雌激素100 μg/(kg·d)，持续2月至12月龄。其他各组小鼠正常喂养，至12 m OVX+E2组小鼠给药结束后，同时检测3月龄组与12月龄各组小鼠ABR阈值，分别采尾静脉采血，检测小鼠血清雌激素水平，用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠，断颈后取双侧耳蜗，分别用于石蜡切片与QRT-PCR检测。所有小鼠低噪音环境下常规饲养，湿度为40%～50%，温度为20～24℃。饲养及实验过程严格遵守《石河子大学医学伦理委员会条例》。

1.2 仪器与试剂

LSM510激光共聚焦显微镜(CarlZeiss公司，德国)，显微手术器械(六六视觉公司，中国)，多功能荧光酶标仪(SANYO公司，日本)，荧光定量PCR检测(Bio-Rad公司，美国)，显微镜(奥林巴斯公司，日本)。17β雌二醇(Sigma，美国)，TUNEL染色试剂盒(英国Roche公司)，戊巴比妥钠(隆盛化工有限公司，中国)，雌激素检测试剂盒(克隆云，中国武汉)，HE染色染料(sigma公司，美国)。

1.3 酶联免疫吸附( ELISA) 法检测小鼠血清雌激素水平

各组小鼠麻醉后，尾静脉采血，每只小鼠取血0.6 ml～1.0 ml，血液室温静置30 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清液(即血清)分装于1.5 ml的EP管中，于-20℃或-80℃保存备用，避免反复冻融，按照雌激素检测试剂盒说明书进行相关检测，用酶标仪测量各孔的吸光度(OD值)，注意实验过程中各孔内避免气泡产生。

1.4 听性脑干反应(ABR)阈值测试

腹腔注射2%戊巴比妥钠将小鼠麻醉后置于隔声屏蔽室内，记录电极置于颅顶正中皮下，参考电极置于双侧乳突，接地电极置于鼻尖。耳机离受测外耳道口1 cm，声音刺激为短声，双耳、21.1 Hz。扫描时间10 s，叠加次数1024，刺激间隔11.10次/ s，最大刺激声强度为90 dB，首先以10 dB 递减刺激声，当接近阈值时以5 dB nHL递减，以能分辨出可重复的 ABR 的Ⅲ波的最低刺激强度作为 ABR 的反应阈值，并重复至少3次，取其均值作为阈值。

1.5 耳蜗的HE染色

用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，生理盐水及4%多聚甲醛灌注固定，断颈后迅速取出双侧耳蜗，置于4%多聚甲醛中，4℃固定24 h;置于10%EDTA脱钙1周，脱钙后，去除标本余骨，进行梯度脱水透明。将耳蜗于平行蜗轴方向浸蜡包埋，平行蜗轴方向连续切片(3 μm)。

HE染色：挑选组织结构完整的石蜡切片进行实验，苏木精染色5 min，冲洗3 s，1%盐酸酒精10～15 s，蒸馏水冲洗，伊红染色3 min，梯度酒精脱水，二甲苯使其透明，中性树胶封片。

1.6 耳蜗的TUNEL染色检测细胞的凋亡率

石蜡切片脱蜡，放入柠檬酸盐溶液中煮沸15 min，用原位细胞死亡检测试剂盒标记，耳蜗切片与标记的核苷酸和末端核苷酸转移酶的混合物暗室孵育(37℃，1 h)，应用olympus激光共聚焦显微镜观察，Imgae-Pro Plus 6.0软件分析，软件统计凋亡细胞与正常细胞的比值，进而计算细胞凋亡率。

1.7 耳蜗螺旋神经节的实时荧光定量PCR

无菌条件下取各组小鼠耳蜗，去除蜗壳，基底膜及螺旋韧带，取出中轴，采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，70℃预变性5 min，42℃退火60 min，4℃延伸5 min反转录形成cDNA，扩增目的基因和内参。QRT-PCR反应条件：95℃预变性2 min，95变性5 s，60℃退火10 s，循环40次。所有数据均使用2-△△CT方法进行处理方法进行处理，目的基因引物序列如表1所示。

Tab. 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠血清雌激素水平的检测

为验证雌鼠去卵巢模型及外源性给予雌激素模型制备成功，我们应用ELISA检测各组小鼠血清雌激素水平。结果显示，各组小鼠雌激素水平比较，3 m组与12 m组，雌激素水平差异无统计学意义，12 m OVX组较12 m组，雌激素水平显著降低(P< 0.01)；与12m OVX组相比，12 m OVX+E2组雌激素水平显著上升(P<0.01，表2)；而与12 m组相比，12m OVX+E2组雌激素水平差异无统计学意义。结果显示：小鼠去卵巢模型制备成功，且外源性给予雌激素后，小鼠体内雌激素水平与12月龄雌鼠一致，雌激素干预组制备成功。

Tab. 2 Comparison of estrogen levels, ABR response threshold and Apoptosis rate of helical ganglion cells in 4 groups of n=10)

2.2 小鼠听性脑干反应(ABR)阈值检测

ABR结果显示，随小鼠年龄增长，ABR阈值逐渐增高，听力下降，12 m组相对3 m组,阈值明显高(P<0.01)，小鼠听力明显降低；去卵巢后，阈值较正常小鼠下降，12 m OVX组相较12m组，阈值增高(P<0.01)，听力降低；给予雌激素后，12 m OVX+E2组相对12 m OVX组，阈值明显降低(P<0.01)，听力有所改善,提示雌激素对听力有一定的保护作用(表2)。

2.3 小鼠耳蜗组织学HE染色

3 m组螺旋神经节结构清晰，神经细胞丰富且排列整齐紧凑，核浆比例正常。12 m组神经细胞数量减少，核浆比例开始失调。12 m OVX组螺旋神经节结构疏松，神经细胞形状不规整且排列紊乱，细胞核固缩，染色质边聚。相比之下12 m OVX+E2 组损伤神经细胞数量明显减少，细胞结构相对完整(图1，见彩图页Ⅰ)。

Fig.1 Cochlear tissue HE staining（×400）

2.4 小鼠耳蜗TUNEL 染色检测螺旋神经节细胞凋亡

为观察老年过程中耳蜗螺旋神经节细胞凋亡情况，以及雌激素对凋亡的保护作用，应用TUNEL染色观察各组螺旋神经节细胞凋亡(图2，见彩图页Ⅰ)。各组耳蜗螺旋神经节TUNEL 染色结果显示(表2)：12 m 组较3 m组细胞凋亡显著增高(P< 0.01)；12 m OVX组较12 m组螺旋神经节细胞凋亡增高(P<0.01)；12 m OVX+E2组较12 m OVX组凋亡降低(P<0.01)。提示雌激素可抑制螺旋神经节细胞凋亡。

Fig.2 Cochlear spiral ganglion TUNEL staining was performed in each group（×400）

2.5 小鼠耳蜗螺旋神经节上凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达水平

应用QRT-PCR技术，在mRNA水平观察螺旋神经节Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA水平的变化。结果显示：12 m组较3 m组，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平升高(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平降低(P<0.01)，12 m OVX组相较12 m组，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平升高(P< 0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平降低(P< 0.01)，12 m OVX+E2组相对12 m OVX组，凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平降低(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平升高(P<0.01)，差异均有统计学意义(表3)。结果显示雌激素可下调老年小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bax mRNA水平，上调抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平。

Tab. 3 mRNA levels of apoptotic proteins in spiral ganglion of n=6)

3 讨论

老年聋是老年人群中最常见的感觉功能障碍，据报道，雌激素对老年聋有一定的保护作用，但这种作用通过何种途径实现，尚不明确。本实验选取C57BL/6J小鼠作为老年聋模型，通过观察衰老过程中螺旋神经节细胞凋亡以及雌激素对其凋亡的影响，探讨雌激素通过抑制螺旋神经节细胞凋亡，实现对老年聋的保护作用。

C57BL/6J小鼠是Cdh23基因突变的近交系小鼠，特点为进行性听力丧失和性早熟，是老年聋研究最常用的模型鼠[6, 7]。本实验选取3月龄小鼠为年轻组，12月龄为衰老组，ABR检测12月龄小鼠听力阈值明显升高。有研究报道，在正常的大鼠中，切除卵巢会导致ABR阈值的升高，而雌激素替代可以逆转这些变化[8]。且雌激素替代治疗，可改善小鼠畸变发声产物(DPOAEs)以及听性脑干反应(ABR)振幅和潜伏期[9]。在我们的研究中，去除小鼠卵巢后，体内雌激素水平降低，ABR阈值较正常老年雌鼠升高，而外源性给予雌激素后，小鼠体内雌激素水平维持在正常雌鼠的生理浓度，ABR阈值较去卵巢小鼠降低，结果与上述实验一致，提示体内稳定的雌激素水平，对老年小鼠的听力损失有一定的保护作用。

神经性老年聋是老年聋中最常见的一种类型，主要以耳蜗螺旋神经节神经元渐行性退化为主，螺旋神经节细胞的坏死或凋亡是老年聋的重要机制之一[10]。目前已有研究初步显示雌激素对听力的保护作用可能与其对神经元的保护作用相关。而雌激素可能通过调节神经营养因子[8]，抑制细胞凋亡[11, 12]等途径发挥对神经细胞的保护作用。本实验通过HE染色观察耳蜗螺旋神经节形态变化，结果显示老年C57BL/6J小鼠螺旋神经节细胞数量减少，核浆比例开始失调；而去卵巢后，螺旋神经节结构疏松，神经细胞形状不规整且排列紊乱，细胞核固缩；在给予雌激素后，螺旋神经节细胞损伤程度明显改善。结果提示，雌激素在老年聋过程中，可减少螺旋神经节细胞的缺失。在听觉系统中，螺旋神经节以及毛细胞的损伤是不可逆的，这将导致永久性的感音神经性耳聋。目前，没有预防或治疗老年聋的有效药物，只能通过助听器进行扩声或通过人工耳蜗进行电刺激来改善听力，其中人工耳蜗可以通过直接电刺激螺旋神经节来有效替代失去的毛细胞的机械感官转导功能，但只有保留了足够多的螺旋神经节细胞时，才能发挥其作用[13]，因此对于螺旋神经节的保护作用，在老年聋的防治中十分重要。研究显示，敲除雌激素受体ERβ后，12月龄小鼠螺旋神经节细胞减少，而雌激素配体与受体可相互调节[12]，因此稳定的雌激素水平可能有助于维持雌激素受体的数量和功能，从而延缓听觉神经元的变性。

研究发现小鼠耳蜗中凋亡途径随年龄增长而上调，年龄相关性的螺旋神经节细胞的缺失，可能与凋亡相关[14]。但螺旋神经节细胞凋亡在老年聋发生发展过程中的机制尚不明确。已知雌激素可以通过抑制神经细胞凋亡，增加神经元存活率[15]。我们通过TUNEL染色观察小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡情况[16]，老年小鼠螺旋神经节细胞凋亡增高，去卵巢小鼠较正常老年雌鼠，凋亡加重，而给予外源性雌激素后，凋亡减少。为进一步观察老年聋过程中螺旋神经节细胞的凋亡程度，应用QRT-PCR检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA水平的变化。我们观察到，老年小鼠螺旋神经节，Caspase-3 、Bax mRNA水平升高，而抗凋亡因子Bcl-2降低，这些结果表明凋亡途径参与耳蜗衰老过程螺旋神经节的缺失。在去卵巢小鼠中，与正常老年雌鼠相比，耳蜗螺旋神经节凋亡蛋白Caspase-3 、Bax mRNA水平明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平显著降低，给予雌激素后凋亡蛋白Caspase-3 、Bax mRNA水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平显著升高。以上结果提示，雌激素可抑制衰老过程中螺旋神经节细胞的凋亡。

在老化的耳蜗中，谷氨酸兴奋毒性可能导致螺旋神经节凋亡，而雌激素在中枢神经系统中被证明可抑制谷氨酸兴奋性毒性诱导的神经元损伤和细胞凋亡[17]。另外，雌激素通过抑制JNK促凋亡通路，能够减少庆大霉素诱导的HCs凋亡[18]。雌激素还可以通过上调抗凋亡因子来抑制ROS诱导的耳蜗HCs凋亡。其中，已知E2在中枢神经系统中可上调神经元中的Bcl-2和Bcl-XL，这些基因中ERE序列的存在提示它们可能是ERs的直接靶点[ 19]。同时，雌激素可通过快速激活PI3K/Akt信号通路诱导Bcl-2表达[20]。这些途径都可能是雌激素抑制螺旋神经节细胞凋亡的潜在靶点。

综上所述，在衰老过程中，雌激素的缺乏会导致C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡增多，听力下降，而给予雌激素治疗后，可改善这种变化，提示雌激素可通过抑制老年过程耳蜗螺旋神经节细胞凋亡，发挥其对听力的保护作用。而雌激素是通过何种途径抑制细胞凋亡，仍需进一步研究。