ESM1基因对崇仁麻鸡生长性状的影响

魏 岳，李海琴，唐维国，武艳平，谭美芳，刘林秀，谢金防

（江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌 330200）

内皮细胞特异性分子-1（ESM1）是一种硫酸皮肤素黏蛋白，ESM1蛋白的N末端具有一个富含半胱氨酸疏水残基区域的典型信号肽序列，与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）相类似，但在C端没有发现与其他蛋白有明显同源的区域，因而其属于IGFBP相关蛋白（IGFrBPs）。IGFrBPs与IGFBPs结构相似，功能也相似，IGFrBPs主要功能有：作为胰岛素样生长因子（IGFs）的载运蛋白，延长IGFs的半衰期；对特异性细胞和组织进行识别、定位；通过调节IGFs和IGFs受体相互作用，调节IGFs的生物学效应；不依赖于IGFs直接调节正常和恶性细胞的生长[1]。IGFrBPs和IGFBPs具有结构同源性和功能的相似性，基于此学者提出IGFBPs超家族的概念[2]。ESM1基因最初从人内皮细胞cDNA文库中克隆而得，由3个外显子和2个内含子组成，其中外显子2编码一个富含苯丙氨酸的特殊区域，该区域是ESM1的重要的功能区域，鸡的ESM1基因定位于Z染色体上，其蛋白与人、鼠、鹅、线虫等的同源性达到90%以上，具有高度的保守性[3-4]。研究发现，ESM1基因对细胞的粘附、迁移、增殖和分化等基本细胞生物学进程具有重要的调控作用[5-9]。

崇仁麻鸡是江西省著名的肉蛋兼用型品种，具有耐粗饲、产蛋率高、肉用价值高等特点，为家禽育种工作提供了重要素材。课题组前期对崇仁麻鸡的差异性状进行全基因组重测序，通过基因注释和通路分析等生物学手段，筛选与生长性状相关的SNP、SV、InDel和CNV等位点或结构，进行大群体验证和表达规律的研究，以期寻找可以用于崇仁麻鸡生长性状改良的分子标记。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验所用的崇仁麻鸡由江西省农科院畜牧所的保种群提供，选取350只母鸡，记录4、6、8、10、12、14、16周龄和20周龄体重。出雏时，采集3只个体的心脏、肝脏、胸肌、腿肌和皮肤组织，液氮保存，提取RNA进行荧光定量PCR检测。

1.2 试剂 基因组血液提取试剂盒购自北京康为世纪；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（Real Time PCR EasyTM-SYBR GreenⅠ）购自成都福际生物技术有限公司；CFX型荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计 根据ESM1基因的RNA序列（GenBank登录号为XM_428357），使用软件Primer 5.0设计实时荧光定量PCR检测引物，由北京华大基因合成，引物序列如表1所示。

1.3.2 PCR-SSCP检测

1.3.2.1 DNA和RNA提取 采用试剂盒分别提取血液基因组DNA和组织样品中的总RNA。

1.3.2.2 SNP分型ESM1基因SNP位点的选取是根据前期崇仁麻鸡差异性状全基因组重测序（30×）比较结果中筛选出的与生长性状相关的SNP位点，随后利用Massarray SNP技术在大群体中进行验证分析，由上海祥音生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 荧光定量PCR检测 反转录和荧光定量PCR按照试剂盒（产品货号：CW2582M和CW0760）说明书进行，利用CFX型荧光定量PCR仪进行反应。PCR循环参数为：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火15 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.4 数据统计 利用SPSS 23.0软件的广义线性模型（GLM）对不同基因型与各性状间的关系进行最小二乘法估计及差异显著性检验，结果均以平均值±标准误表示。用2-△△Ct法检测和计算目的基因mRNA相对表达水平，β-actin为内参基因校准。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP检测及测序结果 对350只崇仁麻鸡ESM1基因的3个SNP进行基因分型，结果如图1和表2所示，样品成功检测344个，每个SNP均检测到3种基因型，其中，ES-1和ES-2位点位于基因的3'端，ES-3位点属于第2外显子的错义突变（G→A，Pro→Leu）。

2.2ESM1基因单倍型分析 利用SHEsis软件对3个SNP位点进行连锁不平衡分析，结果如表3所示，ES-1、ES-2和ES-3位点之间存在强连锁不平衡（D'＞0.8，r2＞0.33）。利用PHASE 2.1软件计算单倍型种类及其频率，理论应有8种单倍型，实际得到6种，命名为H1～H6（表4）。

表1 检测引物信息

表2 ESM1基因SNP位点信息

表3 ESM1基因连锁不平衡系数

表4 ESM1基因单倍型分析结果

2.3ESM1基因单倍型组合与生长性状的关联性分析 剔除个体数较少的H1H5（n=3）和H2H6（n=1）组合，单倍型组合与生长性状关联分析结果如表5所示：4周龄，H1H6组合个体体重极显著高于H1H1、H3H6和H6H6组合个体，H1H1显著高于H6H6组合。6周龄，H1H6组合个体体重极显著高于H1H1、H3H6和H6H6组合。8周龄，H6H6基因型组合个体极显著低于H1H1和H1H6组合。10～12周龄，H1H1极显著高于H6H6组合，H1H1和H1H6显著高于H6H6组合。14周龄，H1H1组合个体极显著高于H3H6和H6H6基因型组合，H1H6极显著高于H3H6组合。16周龄，H1H1组合个体极显著高于H6H6组合，显著高于H3H6组合。20周龄，H6H6组合极显著低于H1H1组合，显著低于H1H6组合。

2.4ESM1基因表达规律及蛋白结构变化预测 如表6所示，ESM1基因在所取得组织样品中均检测到有表达，除心脏和肝脏之间ESM1表达量差异不显著，其余组织间表达量差异均极显著，不同组织中表达量为胸肌＞皮肤＞肝脏＞心脏＞腿肌，腿肌中的表达量最低，胸肌中的表达量最高约为腿肌的60倍。

利用PredictProtein软件预测ES-3位点突变引起ESM1蛋白结构的变化，结果显示，该位点的突变引起ESM蛋白与其他蛋白结合位点发生变化（图2），同时，突变还引起蛋白二级结构中螺旋结构（H）变短以及无规则卷曲序列（L）的长度和位置变化（图3）。

3 讨 论

ESM1最初被认为是一种新颖的内皮细胞分泌的特异性分子，后发现其他组织也有表达，其结构和功能与IGFBP蛋白家族相似，并能够结合肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮因子（VGEF）和碱性成纤维母细胞生长因子（FGF2）等生长因子，参与多种信号传导，具有广泛的生物活性[10-11]。现阶段有关ESM1基因功能研究在医学领域较多，主要和癌细胞的异常表达有关[12-14]。此外，张连昌[15]在流体剪切应力和模拟始终作用后人源MG-63成骨样细胞的基因表达谱结果中发现ESM1基因均显示极显著的表达差异，验证实验表明ESM1基因具有增强成骨细胞的分化和抑制细胞矿化的功能，ESM1基因可作为潜在的对抗失重性骨质丢失的分子靶点。薛倩[16]利用转录组测序对京海黄鸡腿肌不同时间段差异表达基因进行筛选，发现12周和16周相比，差异表达基因中包括ESM1在内多个基因，GO富集显著性分析显示ESM1、IGFBP3、IGFBP5和IGFBP7富集到调控细胞生长功能项中。这些研究表明，ESM1基因与其他IGFBPs超家族成员相似，也具有调节正常细胞生长、分化等生长发育相关的功能。随着ESM1基因作用机理研究的深入，ESM1基因作为调控家禽生长发育候选基因的研究会越来越多。

表5 ESM1基因单倍型型组合对崇仁麻鸡生长性状的影响

表6 ESM1基因不同组织中的表达量

二代重测序技术可以在全基因组范围筛查与目标性状相关的SNP、InDEL和CNV等位点或结构，本研究在崇仁麻鸡重测序结果基础上，筛选出与生长性状相关的ESM1基因作为候选基因进行大群分型并验证。单倍型分析发现ES-1、ES-2和ES-3位点存在强连锁不平衡。单倍型组合与生长性状关联性分析发现，H1H1和H1H6组合对崇仁麻鸡生长性状是2个优势单倍型组合，可以加强这2种组合的选留，而H6H6组合为劣势单倍型组合，可以考虑剔除。本研究发现ESM1基因在初生鸡只的胸肌和皮肤组织中表达较高，在腿肌中表达最低，推测这一结果是基因表达的时空差异以及胸肌和腿肌的肌纤维类型差异造成的。有研究表明，人ESM1基因的3'端非编码区包含一系列的AU-富含元件（AREs），影响mRNA的稳定性并可以被P38信号传导通路调控，而第2外显子属于重要的功能区域，该区域编码富含苯丙氨酸（113FPFFQY118）[17-19]。本研究中ES-1和ES-2突变位于3'端非编码区，ES-3位点突变位于第2外显子，紧邻编码鸡ESM1蛋白富含苯丙氨酸区域（113FPFFQL118）且属于非同义突变，经软件预测发现该位点可能会引起蛋白结合位点以及二级结构的变化，因而这3个位点是否会造成ESM1基因表达的差异或者造成ESM1蛋白功能变化是下一步研究的重点，以确保ESM1基因作为崇仁麻鸡生长性状分子标记的可靠性。

4 结论

本实验中，ESM1基因单倍型组合H1H1和H1H6组合对崇仁麻鸡生长性状为优势单倍型组合，可以加强这2种组合的选留，蛋白结构预测显示ES-3位点引起ESM1蛋白结构或功能的变化，研究表明ESM1基因可作为崇仁麻鸡生长性状潜在的分子标记。