规模化猪场粪污高效脱硫菌的分离、筛选与鉴定

刘雪纯，耿晓晴，丁 轲,*，余祖华，李 旺，李元晓，何万领

（1.河南科技大学宏翔生物饲料实验室，河南洛阳 471003；2.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南洛阳 471003）

目前，我国是世界上养殖量最大的国家，而且规模化程度越来越高。发达的养殖业一方面为人们提供了丰富的动物性食品，提高了经济效益，也为解决就业问题和农民脱贫致富提供了可行之路；另一方面，养殖规模不断扩大，但畜禽粪污处理技术及相关设施没能跟上，导致动物粪尿释放出大量NH3、H2S、吲哚、酚等，严重影响了周边环境，其中NH3和H2S对空气污染最严重[1-2]。近年来，国家逐步加快新农村建设，并提出美丽乡村建设的美好蓝图，养殖场由南向北迁移也主要是基于环境考虑。为保证养殖业的可持续发展，必须做好畜禽粪便等污染物的无害化处理问题。

畜禽粪便污染物包括重金属（Fe、Cu、Zn等）、有机质、病原微生物、NH3、H2S、CH4等，针对不同的污染物所需要的处理技术也不尽相同。当前畜禽粪便污染物处理技术包括物理、化学或生物学方法，其中物理方法处理一般较慢，仅对个别污染物有降解作用；化学方法成本较高，且易形成二次污染，在实际生产中很少使用；生物学方法主要是利用特异性微生物对目标污染物进行吸附、分解、代谢、转化，充分利用了微生物作为自然界分解者的优势[3-4]。目前在规模化养殖场进行粪污无害化处理时，主要检测的指标是生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）和化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）[5]。但是粪污中其他残留物也可造成环境污染或生物富集，其中S2-是残留在粪污中的有害物质之一，该物质不仅会腐蚀管道等金属器具，而且可形成H2S或SO2等有害气体，从而污染大气环境，危害人和动物的健康[6]。针对畜禽废弃物生物硫处理的研究文献并不多，李彪等[7]从猪场分离出一株巴氏芽孢杆菌WJ-2，对H2S的去除率高达62.5%。魏良[8]分别筛选出了动性球菌、短状杆菌、假单胞菌、木霉菌，并将其进行组合发酵鸡粪，H2S的释放量最高可降低59.9%。以上研究主要集中在工业用水中硫的脱除研究，而对畜禽废弃物中硫的脱除研究较少。本研究选择以S2-的残留污染为降解对象，筛选能够脱硫的功能微生物，以期为解决畜禽粪污中的硫残留污染提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 基础培养基：蒸馏水1 000 mL，磷酸二氢钾2.0 g/L，氯化铵0.4 g/L，氯化镁0.2 g/L，硫化钠10 g/L。分离培养基：蒸馏水1 000 mL，磷酸二氢钾2.0 g/L，氯化铵0.4 g/L，氯化镁0.2 g/L，硫化钠10 g/L，琼脂20.0 g/L。活化培养基（NB）：蒸馏水1 000 mL，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，调pH 7.0～7.2。发酵培养基：蒸馏水1 000 mL，磷酸二氢钾2.0 g/L，氯化铵0.4 g/L，氯化镁0.2 g/L，硫化钠20 g/L。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂盒、基因组抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；微量生化发酵管（杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.1.4 主要仪器 PCR仪（美国BIO-RAD公司），凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司），DYY-10C型电泳仪（北京市六一仪器厂），双人净化工作台（浙江苏净净化设备有限公司），电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理 样品采自河南省西华县某规模化猪场的厌氧池、好氧池、氧化塘等不同粪污处理池的不同位点、不同深度的固体或液体样品20份。分别取样品1 g或1 mL样品放入9 mL基础培养基中富集48 h。

1.2.2 菌株的分离与纯化 无菌吸取富集液0.2 mL加入到分离培养基中，37℃振荡培养48 h。然后取富集液0.2 mL涂于分离培养基平板，30℃培养到平板上长出单个且能够分辨的菌落。再根据菌落特征挑取不同的菌落划线接种于活化培养基进行纯化。

1.2.3 脱硫菌株的筛选 取纯化后的菌液，按5%的量接种到发酵培养基中，37℃振荡培养96 h，将培养液4 500 r/min离心20 min，取上清液采用对氨基二甲基苯胺分光光度法[9]测定S2-含量，以不接菌的为对照，每个样品做3个重复，最后取平均值，以此定量确定所分离菌株对脱硫能力的大小，筛选降解能力较强的菌株。菌株对S2-的降解率=（C0－C）/C0，C0为空白对照组中S2-浓度；C为试验组中S2-浓度。

1.2.4 菌株的形态学鉴定 对上述筛选的菌落进行革兰氏染色，观察菌株的显微形态。

1.2.5 菌株的生理生化鉴定 无菌吸取适量菌液加入到微量生化发酵管中，然后倒置于盛有1 mL灭菌蒸馏水的试管中，置37℃恒温培养24 h，观察各管颜色变化情况并记录结果。

1.2.6 菌株16S rDNA的鉴定 采用细菌鉴定的16S rDNA通用引物，P1：5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´，P2：5´-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3´，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

按照细菌基因组提取试剂盒说明提取分离菌株的基因组DNA，并以其为模板，PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物（10 mmol/L）分别为1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，MgCl22.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）1μL，模板DNA 0.5μL，超纯水38 μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，60℃ 50 s，72℃50 s，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。吸取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成测序。将测序结果提交到GenBank中进行BLAST比对，选取相似性较高的序列，利用DNAstar6.0软件包中的Meglign将所测定的序列与国内外已发表的相应片段进行同源性比较，用MEGA5.0软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离，用Neighbor-Joining法构建序列进化树。

2 结果

2.1 菌株的初筛结果 通过分离培养基初步获得14株菌株，菌落形态特征见表1。

表1 分离菌株菌落形态特征

2.2 菌株的显微形态特征 在显微镜下，菌株有的呈短粗杆状，有的呈长杆状，有的呈椭圆状，有的单个存在，有的呈链状排列，有的能形成芽孢。部分菌株显微形态见图1。

2.3 菌株脱硫活性测定结果 试验测得对照组S2-残留量为6.51 mg/L。由表2可以看出，14株分离菌对S2-的去除率为38.16%～86.12%，因此，考虑菌株对S2-的去除率，确定菌株JFF2和JFF3脱硫效果较好，并作为下一步的研究对象。

2.4 菌株生理生化鉴定结果 如表3所示，JFF2和JFF3分别具有不同的生理生化特征，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，其结果分别基本符合芽孢杆菌和粪产碱杆菌的典型特征。

2.5 菌株16S rDNA的鉴定结果 分别以菌株JFF2和JFF3基因组DNA为模板，经PCR扩增后在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳。如图2所示，在约1 500 bp处有一清晰的条带，与预期大小一致。

表2 不同菌株处理后污水的S2-含量及去除率

表3 JFF2和JFF3生理生化试验结果

2.6 序列测定结果及系统进化树分析 将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果显示JFF-2序列长度为1 450 bp，JFF-3菌序列长度为1 440 bp。同源性比较结果可知，JFF-2与地衣芽孢杆菌的同源性较高，其中与Bacillus licheniformisATCC 14580基因序列同源性最高为99.9%，JFF-3与粪产碱杆菌的同源性较高，其中与Alcaligenes faecalisNBRC 13111基因序列同源性最高为98.9%。进化树分析结果与同源性比较的结果相似，JFF-2与Bacillus licheniformisATCC 14580处于同一亚支，JFF-3与Alcaligenes faecalisNBRC 13111处于同一亚支（图3、4），在菌株分类上属于同一个种，分别为地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌。

3 讨 论

从自然界中生产者、消费者、分解者三者循环存在相生相克的原理分析，在某种物质污染的环境中必然存在能够降解这种物质的微生物。所以本研究分析认为猪场粪便中存在硫化物，在其放置的过程中，必然会有降解硫化物的微生物的存在[6,10]。本研究从规模化猪场粪污处理的不同环节分别取样进行分离，并采用以Na2S为基础营养的条件下进行筛选，事实也证明，自该种培养基平板挑取的菌落纯化后对Na2S均有不同程度的降解作用，这就大大降低了利用普通培养基盲筛所带来的繁杂工作量。同时也说明在不同级别中均存在降解硫化物的不同种类的微生物，在实际生产中它们可能起相互协同作用[11]，所以在单菌株筛选后，要想进一步提高降解率，最好选择不同菌株混合发酵。

目前已发现的脱硫微生物有硫杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、短杆菌属、红球菌属等10多个种属[11-12]。尚丽勤[13]将筛选出的互补拮抗除臭微生物进行菌种复配，脱硫复合菌株使H2S平均释放量比对照组降低46.26%。周东兴等[14]自蚯蚓粪中分离获得了芽孢杆菌、黄单胞菌和假单胞菌各1株，经组合后可使H2S降解率提高71.53%。Hisashi等[15]研究发现，沼泽红假单胞菌可清除污水中99.8%的H2S。所以不同的菌株以及不同的菌株组合对不同底物中的H2S降解效率不同，因此，要想获得最佳的降解效果，最好是自降解底物中进行分离筛选，这样筛选的微生物不仅能够脱硫，而且能够在含硫的污染物基质中快速增殖，有利于提高降解效率。本研究处理对象是规模化猪场的污水，因为污水中存在有硫化物的残留，所以会带来H2S的排放污染，也会氧化污水处理过程中的金属设备，因此规模化猪场的污水中硫的降解对于猪舍空气质量、环境保护及延长设备使用寿命等具有重要的意义。本研究从规模化猪场的污水中分离了2株微生物，经鉴定分别为地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌，其对硫的降解率分别可达84.02%和86.12%。根据国家农田灌溉水质标准要求硫化物≤1mg/L[16]，而本研究所筛选的菌株JFF2处理后污水中的硫化物的残留量为1.04 mg/L，基本达到了排放标准，而菌株JFF3处理后污水中的硫化物含量仅为0.9 mg/L，从而完全可达到国家排放标准，实现了猪场污水的安全排放，防止通过污染的土壤和水导致农产品、瓜果的残留，有利于保证人类的食品安全。

4 结 论

本试验从规模化猪场中分离筛选了2株能够高效降解硫的细菌JFF2和JFF3，降解率分别为84.02%和86.12%，经鉴定分别为地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌。