东北泡菜中抑菌微生物的分离筛选及鉴定

燕平梅，宋敏丽，赵文婧

(1.太原师范学院 生物系，太原 030619;2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，太原 030619)

泡菜是以白菜、萝卜为主要原料，再配以辣椒、姜、大蒜等作为辅料，添加食盐及其他调味品等，利用蔬菜自身的微生物或人工添加的微生物在厌氧条件下进行发酵产生的酸性食物。泡菜中含有丰富的营养,包含大量的各类维生素、胡萝卜素、钙、铁、磷等元素，以及丰富的乳酸菌。蔬菜发酵初期，表面的杂菌数量大于乳酸菌。随着发酵的进行，杂菌的种类和数量减少，乳酸菌数量迅速增加。发酵后期，泡菜中的微生物几乎都是乳酸菌[1-3]。1930年，Pederson首次提出了蔬菜的乳酸发酵过程中明串珠菌起到了启动的作用[4，5]。20世纪90年代后期研究较前期更深入，研究转向泡菜中乳酸菌的演替规律。我国学者对泡菜发酵过程进行了研究[6-9]。主要致力于四川泡菜和韩国泡菜中微生物的研究，进行菌种分离、筛选、鉴定以及纯化[10]，对于泡菜工业发展起到了举足轻重的作用。

东北泡菜是东北地区的一种特色食物。常采用当地盛产的大白菜腌制而成，极具东北地方特色。但是东北泡菜与韩国泡菜和四川泡菜在辅料使用上不同，东北泡菜中使用的辅料除食盐外，未添加其他辅料，这种泡菜也被称为酸菜[11]。不断有学者进行韩国泡菜和四川泡菜中微生物的研究，但对于东北泡菜中微生物的研究少之又少。因此，我们对东北泡菜中微生物进行分离、筛选和鉴定，分离有抑菌能力的微生物，对于进一步探究东北泡菜的发酵机理和营养价值具有重要意义。

抑菌微生物就是具有抑菌活性的一类微生物，也称拮抗微生物[12]。泡菜作为一种食品，在腌制及发酵过程中难免会有各种微生物的存在。抑菌微生物的存在不仅要保证泡菜的食用安全，还要求不能改变泡菜原有的风味。因此，本研究以抑菌微生物的分离、筛选为出发点研究东北泡菜中的微生物及其抑菌功能，从而进一步了解东北泡菜的发酵本质和营养价值，促进东北泡菜工业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

于超市购买的袋装延边传统泡菜，延吉市三胜食品泡菜厂生产。

1.1.2 菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；大肠杆菌(Escherichiacoli)。

1.1.3 试剂

细菌DNA提取试剂盒：生化试剂；Taq DNA 聚合酶：北京天根时代公司。

1.1.4 实验仪器

Life Touch基因扩增仪 杭州博日科技有限公司；HYBAID LIMITED PCR仪、DcodeTM凝胶成像系统 Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜中乳酸菌的分离

采用BCG牛乳培养基分离泡菜中的乳酸菌，参照发酵工程实验的方法[13]。

对东北泡菜进行不同浓度的稀释，在BCG牛乳培养基平板上涂布，涂好的平板于30 ℃培养箱中倒置封口培养48 h，观察菌落形态，筛选有变色圈的菌落。

1.2.2 抑菌能力的判断

利用管碟法，在牛津杯中滴加乳酸菌发酵液离心后的上清液，以乳酸菌培养基MRS为对照试验，判断分离的乳酸菌抑菌能力的大小。

1.2.3 抑菌微生物的鉴定

1.2.3.1 革兰氏染色鉴定

具体实验操作方法参照《微生物学实验》[14]。

1.2.3.2 过氧化氢酶实验

用接种环取一小环菌涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性。

1.2.3.3 生理生化鉴定

应用API50CH试剂条和 API50CHL培养基按照厂商的指示说明，对分离菌株进行糖发酵反应，实验结果由APILABPLUS(Version 3.3.3,Bio-Merieux,France)程序和标准分类法描述。

1.2.3.4 16S rRNA基因鉴定

基因组DNA提取：按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作方法。

16S rRNA基因PCR扩增：以原核生物通用引物8F和1542R为上、下游引物扩增16S rRNA基因[15]。

fD1(5′-AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3′)；

rD1(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

分别靶向大肠杆菌(Escherichiacoli)16S rRNA的8～27位和1525～1542位核苷酸。PCR产物为1.5 kb。

16S rRNA基因序列分析：测序及分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 分离微生物结果

图1 分离的乳酸菌(48 h)Fig.1 Isolated Lactobacillus (48 h)

由图1可知，在30 ℃下BCG培养基中培养48 h后，培养基表面有乳白色菌落，菌落较小，菌落呈圆形，中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐。菌落且周围可看到明显的变色圈，拟似为乳酸菌。分离出110株拟似乳酸菌，进行抑菌实验。

2.2 抑菌实验

a.抑制金黄色葡萄球菌

b.抑制大肠杆菌

注：图中C为对照；A，B为乳酸菌发酵液抑菌实验。

将分离乳酸菌的液体培养液加到牛津杯中培养48 h，可以看到牛津杯周围有一个圆形区域没有金黄色葡萄球菌菌落(见图2中a)，其他地方有菌落生成，说明从泡菜中分离的乳酸菌可抑制金黄色葡萄球菌的生长。分离的110株拟似乳酸菌中有62株可抑制金黄色葡萄球菌的生长。由图2中b可知，从泡菜中分离的乳酸菌可抑制大肠杆菌的生长。分离的110株拟似乳酸菌中有91株可抑制大肠杆菌的生长。

2.3 抑菌微生物的鉴定

2.3.1 革兰氏染色及过氧化氢酶实验结果

挑取边缘光滑、圆形菌落的细菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，可看到为杆状细菌，且菌体为紫色，说明细菌为革兰氏阳性菌，由此判断为拟似乳酸菌。

先在玻片上滴1滴5%过氧化氢，然后用接种针挑取1环菌涂抹于液体中，没有气泡产生，说明分离的菌过氧化氢反应为阴性，所以判断分离的菌为拟似乳酸菌。

2.3.2 生理生化实验

对分离有抑菌作用的153菌株进行糖发酵反应，应用API50CH试剂条和 API50CHL培养基鉴定，结果为62株抑制金黄色葡萄球菌的乳酸菌中11株为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；51株为Lactobacillusacidophilus。91株抑制大肠杆菌的乳酸菌中72株为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；19株为Lactobacillusbrevis。

表1 API50CH试剂条成分Table 1 Reagent components of API50CH

续 表

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

2.3.3 16S rRNA基因鉴定

将具有抑菌作用的乳酸菌进行16S rRNA基因鉴定。 提取具有抑菌作用的乳酸菌的基因组DNA，以通用引物8F和1542R为上、下游引物扩增16S rRNA基因，结果见图3 。将PCR扩增的具有抑菌作用的乳酸菌16S rRNA基因产物进行测序，结果为62株抑制金黄色葡萄球菌的乳酸菌中11株植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；51株为Lactobacillusacidifarinae。91株抑制大肠杆菌的乳酸菌中72株为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；19株为Lactobacillusacidifarinae。

图3 提取DNA模板的 PCR扩增反应图谱Fig.3 PCR amplification response spectrum of DNA template

注：泳道M表示标样；1，2表示乳酸菌PCR扩增反应图谱。

3 讨论

蔬菜收获后表面所含的微生物种类多、数量大，如大白菜外叶含微生物约13×108个/g，但有益菌一般数量都较低。蔬菜发酵初期首先是附着在原料表面的杂菌不断生长繁殖，主要有微球菌属、单胞菌属、酵母菌属，也有肠道细菌属、克雷伯氏菌属、棒杆菌属，同时乳酸菌也随之增殖，乳酸菌主要为球状乳杆菌、链球菌、明串珠菌、片球菌等[16，17]。随着发酵的进行，杂菌的种类和数量减少，乳酸菌数量迅速增加，占细菌总数的比例不断增加。发酵后期，泡菜中的微生物几乎都是乳酸菌，乳酸菌大多为植物乳杆菌、短乳杆菌。前人研究发现乳酸菌不仅在泡菜风味方面起到关键的作用，还在泡菜发酵过程中起到抑制其他杂菌生长的作用[18，19]。本实验结果得出东北泡菜的乳酸菌具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用，经生理生化(糖发酵反应)鉴定结果为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，与前人的研究结果一致。

本实验结果得出东北泡菜的乳酸菌具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用，经16S rRNA基因鉴定，结果为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacillusacidifarinae，据资料报道[20]，Lactobacillusacidifarinae是在比利时的酸面团中发现的新菌种，此菌的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，可用糖发酵反应产物的不同来区别两者。本实验用生理生化(糖发酵反应)和基因鉴定泡菜中具有抑制作用的乳酸菌，由于Lactobacillusacidifarinae的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，难以区别，以糖发酵反应的结果作为鉴定的结果。