Zn 2+浓度和藻密度对多刺裸腹溞生命表统计学参数的影响

张燕 ，张庆 ，席贻龙 ，黄亚 ，赵清清 ，蒋琦辰

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；2.安徽师范大学生命科学学院，安徽 芜湖 241000）

随着工业的发展和进步，经济迅猛增长的同时也给环境造成一定的破坏，冶金电镀等各种工业废水的不合理排放所产生的重金属进入河流和湖泊等地从而污染水体，对水生生物的生存和繁殖造成了很大的负面影响，并且通过食物链的富集作用给人类的健康造成了严重的威胁。锌（Zinc）是我们日常除了铁、铝及铜之外最常见的金属，是生物体所必需的微量元素之一，是许多重要的酶的金属辅基，细胞中许多生物蛋白质的结构和功能依靠锌来维持着，例如，许多转录因子和DNA修复蛋白的功能区是锌指蛋白[1-2]，对于维持生物体中的一些决定性的新陈代谢具有非常重要作用。如果摄入过多、不足、不平衡或缺乏，都将导致机体不同程度地出现异常或发生不同程度的疾病，高浓度的锌会影响大多数以水环境为栖息地包括浮游动物在内的水生动物的生存和繁殖[2-3]，因此研究锌对于水生浮游生物的影响具有重要的意义。

在淡水生态系统中，浮游动物的主要食物来源是浮游藻类，它们又是食物链中较高营养级生物的捕食目标，因此，在淡水生态系统的食物链和食物网中浮游动物起着重要的呈递作用[4]。枝角类是淡水浮游动物的重要组成类群之一；多刺裸腹溞（Moina macrocopa）分布范围广泛、繁殖速度快、适应能力强，是易于进行人工培养的小型淡水枝角类[5]，在淡水生态系统的结构、功能和物质生产力的研究中具有非常重要的意义[6]。由于其较快的生长时间、较短的生命周期和能相对快速的对环境的改变做出反应，多刺裸腹溞被认为是水环境指示生物和毒性测试的受试生物[7]。曾有人做过关于 Cu、Cd、Pb[8-9]对多刺裸腹溞的影响试验，但迄今为止，关于锌对多刺裸腹溞的存活率以及繁殖率等的影响未见报道。

该文以淡水水体中常见的多刺裸腹溞作为受试生物，研究了在3种不同的斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）食物密度下不同的Zn2+浓度对多刺裸腹溞生命表统计学参数的影响，意在分析重金属污染物毒性与食物供应之间的内在关联，以得出多刺裸腹溞对水体环境中Zn2+污染物的敏感程度，为筛选出更好的监测水体污染物Zn2+的敏感性指标。

1 材料与方法

1.1 多刺裸腹溞的来源与培养

受试生物是由香港科技大学馈赠的多刺裸腹溞，实验室内的培养液是由曝气自来水（pH值7.0）与培养滤液组成的混合液（1∶1体积比），由HB-4培养基[7]培养的、处于指数增长期的斜生栅藻作为该次试验所用的饵料[3]，高速离心浓缩后经过显微计数使用[10]。实验开始之前，在（25±1）℃、进行自然光照的恒温培养箱内将多刺裸腹溞进行预培养到F3代。期间，每天更换一次一半的多刺裸腹溞培养液，并投喂密度分别为 0.5×106、1.0×106和 2.0×106cells/mL的斜生栅藻。

1.2 测试液的配置

试验用氯化锌（ZnCl2）来自上海化学试剂总厂，分析纯（纯度≥98.0%），化合物中Zn2+含量是实际使用的重金属量。按照母液稀释法配置测试溶液，进行实验之前，先用蒸馏水将氯化锌配制成10 g/L的原液，再用蒸馏水将原液稀释成100 mg/L的母液，放置在温度为4℃冰箱中备用，母液每隔3 d进行一次配制。试验过程中用培养液将母液配制成所需浓度的测试溶液。

1.3 急性毒性试验

为了找到适当的毒物浓度用开展进行生命表慢性毒性试验，预先需要进行为期48 h的急性毒性实验。根据正式试验前的预试验结果，把Zn2+浓度设定为 0、1.8、2.4、3.2、4.2、5.6 和 7.5 mg/L 共 6 个浓度梯度，其中0 mg/L是空白对照组；根据水生生物毒性检测国家标准（GB/T16310.1—1996），从龄长在12 h内的多刺裸腹溞幼体中随机选取10只试验体放入50 mL玻璃烧杯中，加入50 mL测试液，进行急性毒性预试验，每组均设置3个重复。试验在（25±1）℃、恒温暗室培养箱中进行，在24 h和48 h后进行观察并记录所有烧杯中多刺裸腹溞的存活个体数，以晃动烧杯15 s后多刺裸腹溞不运动为急性毒性试验的死亡标准[3]，得到Zn2+对多刺裸腹溞的最小全致死浓度分别为：0.5×106cells/mL斜生栅藻下为3 mg/L，1.0×106cells/mL 下为 5 mg/L，2.0×106cells/mL下为4.5 mg/L。在预试验基础上再设置0.54、0.72、0.96、1.28、1.68 和 2.24 mg/L 共 6 个 Zn2+浓度组，另外建立一个空白对照组，每组设置3个重复。以相同的方式进行试验，并且选择使用概率单位法获得48h-LC50值。

1.4 生命表试验

依据急性毒性试验得出的LC50值，将Zn2+浓度设置为 0（空白对照）、20.0、50.0、80.0、110.0 和140.0μg/L，总共6个Zn2+浓度组，实验中斜生栅藻的密度设置为 0.5×106、1.0×106和 2.0×106cells/mL。随机将龄长在12 h内的多刺裸腹溞幼体挑出作为实验母体放入50 mL的玻璃烧杯中，并且添加50 mL测试液（其中分别含有相应浓度的Zn2+和相应密度的斜生栅藻）。每个浓度组设置3个重复，每个重复里面均放入10只多刺裸腹溞幼体。试验在（25±1）℃、恒温暗室培养箱中进行。在进行试验的整个周期内，每24 h观察并记录每个烧杯中的母体存活数和新生的幼体数目，将烧杯中相对应Zn2+浓度和的相应藻类食物密度的测试液更换1次，并且进行试验直到所有母体全部死亡。

1.5 相关参数的定义和计算

生命表统计学参数主要有：特定年龄繁殖率（mx）、生命期望（e0）、特定年龄存活率（lx）、世代时间（T）、内禀增长率（rm）和净生殖率（R0）。

特定年龄繁殖率（mx）：表示的是X年龄组每个多刺裸腹溞个体平均所产的雌性后代数；生命期望（e0）：表示出生后的多刺裸腹溞个体平均能存活时长的估算值；特定年龄存活率（lx）：是指X年龄组的多刺裸腹溞开始时存活个体的百分比；世代时间（T）：多刺裸腹溞从亲代出生到子代出生所经历的时间，T=Σlxmxx/R0；内禀增长率（rm）：是在特定试验条件下多刺裸腹溞种群的最大增长率；rm的精确值是在根据方程rm=ln R0/T估算的基础上，根据方程在计算机中运算求得[6]；净生殖率（R0）：指的是多刺裸腹溞种群经过一个世代后的净增长率，R0=Σlxmx。

1.6 数据的统计与分析

采用SPSS 20.0软件和Office软件对各个生命表统计学参数进行数据的统计和分析。对试验获得的各个参数数据进行正态分布检验，将与正态分布相符的数据采用单因素方差分析、双因素方差分析和LSD多重比较，分析各Zn2+浓度组间以及各食物密度组间的差异显著性。各组多刺裸腹溞的平均存活时间利用生存分析中的Kaplan-Meier模型进行计算，并且对多刺裸腹溞在各测试组和对照组间存活时间的差异显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 Zn2+对多刺裸腹溞的急性毒性

急性毒性试验结果显示，在（25±1）℃、没有光照的条件下，多刺裸腹溞的病死率与Zn2+浓度间存在显著的剂量-效应关系。Zn2+对多刺裸腹溞的48 h LC50值：0.5×106cells/mL 下为 1.096 mg/L，95%置信区间为 0.953～1.245 mg/L；1.0×106cells/mL 下为1.893 mg/L，95%置信区间为 1.683～2.120 mg/L；2.0×106cells/mL下为1.784 mg/L，95%置信区间为1.605～1.979 mg/L。

2.2 Zn2+浓度和食物密度对多刺裸腹溞的生存和繁殖的影响

试验结果表明，Zn2+浓度和食物密度对多刺裸腹溞的存活率和生殖率都没有显著性影响（P＞0.05）（图1）。

2.3 Zn2+浓度和食物密度对多刺裸腹溞各生命表统计学参数的影响

在3种食物密度下，生命表统计学参数显示：Zn2+浓度对多刺裸腹溞的出生时的各个主要的生命表参数的显著的影响（P＜0.05）程度不明显。方差分析结果表明，通过与各个食物密度下的对照组进行比较，0.5×106cells/mL食物密度下，140μg/L的Zn2+对多刺裸腹溞的生命期望具有显著影响（P＜0.05）；1.0×106cells/mL食物密度下，50μg/L的Zn2+对多刺裸腹溞的内禀增长率有显著的影响（P＜0.05）。2.0×106cells/mL食物密度下，80μg/L的Zn2+显著降低了其内禀增长率（表1）。双因素方差分析结果表明，Zn2+浓度对多刺裸腹溞的种群内禀增长率有极显著影响（P＜0.01），藻密度对多刺裸腹溞的世代时间有显著影响（P＜0.05），藻密度对多刺裸腹溞的净生殖率和种群内禀增长率均有极显著影响（P＜0.01）。藻类食物密度和Zn2+浓度之间的交叉互作作用对多刺裸腹溞的各生命表统计学参数均无显著影响（P＞0.05）（表2）。多重比较结果显示，3种食物密度间，多刺裸腹溞的世代时间在1.0×106cells/mL食物密度下显著短于0.5×106和2.0×106cells/mL食物密度下；净生殖率和种群内禀增长率均在1.0×106cells/mL食物密度下最高，2.0×106cells/mL食物密度下最低。50.0和80.0μg/L的Zn2+使多刺裸腹溞的种群内禀增长率显著高于对照组和其它各Zn2+浓度组。

表1 三种食物密度（×106 cells/mL）下不同浓度的Zn2+对多刺裸腹溞出生时的生命期望、世代时间、净生殖率、种群内禀增长率和平均寿命的影响

图1 三种食物密度和不同Zn2+浓度下多刺裸腹溞的存活率和繁殖率

表2 食物密度和Zn2+浓度对多刺裸腹溞各主要生命表统计学参数影响的双因素方差分析结果

2.4 Zn2+浓度与多刺裸腹溞各主要生命表统计学参数之间的关系

Zn2+浓度与多刺裸腹溞的生命表统计学参数中的生命期望和平均寿命在0.5×106cells/mL食物密度下存在着显著的剂量-效应关系，可分别描述为：e0=-0.004x2+0.063x+348.604（R2=0.434,P＜0.05）和t=-0.025x2-0.507x+84.468（R2=0.434,P＜0.05）。

3 讨论

3.1 重金属污染物的相对毒性

随着工业的发展，湖泊水体受到各种重金属的污染已经日益严重[11]，而重金属具有的难以降解、在生物体内富集和具有毒性大等特点，对生活在其中的生物具有直接的毒害作用。刘昔等[8]分析表明在湖泊水体中广泛存在的六种重金属离子浓度由高到低依次为 Zn、Pb、Cr、Cu、Cd、Hg。已有研究表明 25 ℃，1.0×106cells/mL 藻密度下，Cu2+和 Cd2+对多刺裸腹溞的48 h LC50值分别为0.106 mg/L和0.117 mg/L[9]，可见，Zn2+对多刺裸腹溞毒性相比较Cu2+和Cd2+小。另有研究表明，1.0×106cells/mL藻密度下，Pb2+对隆线溞（Daphnia carinata）、模糊网纹溞（Ceriodaphnia dubia）、蚤状溞（Daphnia pulex）的 48h-LC50值分别为 0.4 mg/L[12]、20.9 mg/L[12]、0.050 mg/L[6，13]；这表明对Pb2+的敏感性，多刺裸腹溞比模糊网纹溞更强，但又比隆线溞和蚤状溞等溞类弱。本研究结果表明，多刺裸腹溞对Zn2+具有一定的敏感性，但是这种敏感性在一定的食物密度下会被降低，枝角类对Zn2+的相对毒性相对于其他重金属而言较弱。

3.2 食物密度和Zn2+浓度对枝角类繁殖的影响

较低或较高浓度的食物密度对枝角类的繁殖有显著影响，大型溞（Daphnia magna）、多刺裸腹溞、短腹平直溞（Pleuroxus aduncus）、角突网纹溞（Ceriodaphnia cornuta）和老年低额溞（Simocephalus vetuloides）等枝角类的繁殖率显著降低[14]。该试验结果与之类似，多刺裸腹溞的净生殖率在2.0×106cells/mL食物密度下最低，1.0×106cells/mL食物密度下最高。

大多数污染物都有不利于枝角类的繁殖，如Pb2+污染降低了多刺裸腹溞的繁殖率[6]。有研究表明，Zn2+具有环境雌激素的特性[11]，25.0μg/L的Zn2+能够显著地增加了发头裸腹溞（Moina irrasa）前两窝的怀卵数[12]。该研究中，Zn2+浓度对多刺裸腹溞的繁殖率的影响不显著；Zn2+浓度和藻密度对枝角类的相关生命表中各统计参数均无显著交叉互作作用，Zn2+浓度对枝角类的毒性作用受到食物浓度的影响在一定的范围内变化较小，这可能是由于Zn2+本身是生物体所需的微量元素之一，参与生物体本身的多种生命活动过程，所以对于枝角类的毒性作用不是很明显。

研究表明，食物浓度的提高通常能够显著提高枝角类的繁殖率[15]。过高或过低的食物密度对多刺裸腹溞抵御外界环境变化具有不利的影响，而当动物可获得的食物保持在中等水平时，能量的代谢与需求会在很大的程度上提高多刺裸腹溞抵御外界环境的能力。该研究结果中，当食物密度从0.5×106cells/mL 升高为 1.0×106cells/mL 时，Zn2+浓度对多刺裸腹溞的繁殖率的影响有一定的消减作用，而当食物密度升高至2.0×106cells/mL时，Zn2+又对多刺裸腹溞的繁殖率的产生了不利的影响。

3.3 食物密度和Zn2+浓度对枝角类种群增长的影响

当蛋白核小球藻（Chlorella vulgaris）的密度升高时，NH4Cl对网纹溞、多刺裸腹溞和蚤状溞、Zn2+对网纹溞和蚤状溞等种群增长的遏制作用强度会逐渐下降，主要原因是一定程度上食物密度的增加能够降低不利的环境因素对浮游动物的毒性[3，13，16-18]。然而，该研究中，每种食物密度下的Zn2+浓度多刺裸腹溞的种群内禀增长率都没有显著的影响；这可能由于多刺裸腹溞对食物资源的耐受性比较强，所以在同一种食物密度下，不同的浓度的Zn2+对多刺裸腹溞的毒性作用的影响不显著。但当忽略食物密度的影响时，50.0和80.0μg/L的Zn2+浓度对多刺裸腹溞的种群内禀增长率的影响显著高于对照组和其它各Zn2+浓度组，表现出显著的促进种群增长的效果。