蒙椴组培腋芽增殖快繁的影响因子研究

赵淑珍，穆晓松，石艳龙，马雨峰，石 健

（1.承德市园林管理中心，河北 承德067000；2.承德县园林绿化管理服务中心，河北 承德067000；3.河北丰宁抽水蓄能有限公司，河北 丰宁068350；4.承德德营苗木种植有限公司，河北 承德067000）

蒙椴（Tilia mongolicaMaxim.）是椴树科、椴树属植物，分布于中国北部各省。萌芽力强，秋叶亮黄色，具有一定的耐荫性。抗污染能力强，观赏效果好，在道路绿化中很受欢迎。蒙椴花冠秀美、浓郁芳香，可制成干花食用，是制做饮料的上等原料，也是很好的蜜源植物。其木材纹理细致紧密，是优质建筑和家具的材料。其茎皮纤维坚韧，可用于造纸或替代麻[1]。

但椴树种皮硬，不易透水，胚休眠和种子内抑制物的存在造成椴树种子发芽率很低、出苗不整齐[2~5]。自然界中蒙椴花雄蕊先熟，因而自花几乎不育，异花授粉，结实率也较低，一般不超过10%。大部分果实无发育的种子，繁殖率极低，现在并未找到有效的快速扩繁方式。植物组织培养快繁是短期内解决种苗数量限制的有效途径之一，但在植物组织培养的过程中常出现褐化以及玻璃化现象[7-8]。褐化和玻璃化现象是在继代过程中常见的问题，严重影响组培快繁的成功率。为优化蒙椴组织培养的快繁体系，本研究选用蒙椴腋芽为外植体进行了腋芽增殖途径的组培研究，对不同基本培养基种类及激素条件、pH值、继代周期对蒙椴继代繁殖系数的影响进行了探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为引自承德丰宁县实生蒙椴幼树，栽植于丰宁县苗圃。试验中MS、WPM、DKW作为基本培养基，药品均为国药公司生产。

培养条件：温度24℃，光照时间15h/d，光照强度2000lx，室内相对湿度30%左右。接种培养30d后，观察腋芽生长状况。以下试验条件均与此相同。

1.2 方法

1.2.1 组织培养初代外植体的获得

春季5~6月份，采集实生苗1a生新梢，用清水冲洗干净，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50~60s，用无菌水洗涤3次，然后用20倍84消毒液摇床上振荡消毒15~20min。无菌水冲洗20~30min后，再用无菌水洗涤3次。

1.2.2 初代诱导阶段基本培养基的筛选

采用MS、DKW和WPM作为基本培养基，分别加入BA 2.0mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值调为6.0。每处理重复10瓶，每瓶内接种10个带腋芽的茎段。接种培养30d后，观察腋芽生长状况。

1.2.3 增殖阶段激素组合的筛选

将诱导伸长的腋芽接种到含不同浓度BA（0、0.05、0.1、0.2mg/L）和NAA（0.01、0.02、0.05mg/L）组合的WPM培养基上，共12个处理；在确定激素组合后，附加不同浓度的GA3（0、1.0、2.0mg/L），观察分化芽生长情况。

1.2.4 继代周期的选择

长势良好的无菌苗作为试验材料，切除无菌苗的基部以及叶片，之后将无菌苗切分为带有1~2个腋芽的茎段。然后将带有腋芽的茎段转移到准备好的继代培养基中，在LED灯光照射下进行培养。每培养瓶中放入5个茎段，每试验处理共50个茎段，3次重复。30d后观察茎段的长势，并统计节间距、腋芽数和植株状态等。各试验处理的对照培养条件（CK）为：继代周期40d；光照条件1500lx；培养基WPM添加BA 0.2mg/L、IBA 0.04mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L。继代周期的调整：将培养40d的组培苗，切分后按照3个不同继代周期进行接种培养，分别为25、30、35d，比较不同继代周期对下一继代腋芽萌发及生长状态的影响。

1.2.5 增殖阶段培养基pH值的调整

将增殖培养基（WPM+BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.0g/L）的pH值分别调节为5.6、5.8、6.0、6.2，共4个处理。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对蒙椴腋芽诱导的影响

经消毒灭菌处理后的外植体接种在MS、DKW、WPM（附加BA 2.0mg/L、NAA 0.01mg/L）3种不同元素含量的基本培养基上，诱导结果如表1。不同基本培养基虽然都能诱导腋芽萌发，但诱导情况差异很大。其中WPM基本培养基外植体5～7d芽苞开始膨大，个别开始抽出叶片，长势良好，启动率较快；而MS和DKW基本培养基经过25d左右腋芽才开始有变化，部分芽一直处于膨大状态，不再进一步发育。经多重比较，3种培养基的萌芽率差异显著，WPM培养基的萌芽率极显著高于其他基本培养基，这表明基本培养基对蒙椴初代培养具有一定的影响，WPM可作为诱导蒙椴腋芽萌发的启动培养基。

2.2 植物激素浓度对蒙椴腋芽增殖的影响

将诱导伸长的腋芽剪成茎段，分别转入不同的增殖培养基中，30d后进行统计调查，试验结果见表2。不同浓度的激素组合对蒙椴腋芽增殖系数具有显著影响。在各处理中，BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L的腋芽增殖系数最高，其增殖系数为4.85，叶片数量多、浓绿。在试验过程中发现，添加了BA和NAA的激素组合，虽然提高了增殖效果，但是蒙椴组培苗茎矮小、节间比较短，茎纤细。为此在试验中添加了GA3来促进已分化的腋芽伸长生长，结果表明：不同浓度的GA3对蒙椴腋芽伸长生长有一定的作用，随着浓度的提高，苗高增长明显、叶子数量增多，当GA3浓度为2.0mg/L时，苗高达7.8cm，比不添加GA3的高34.5%（表3）。

表1 基本培养基对腋芽诱导培养的影响

表2 蒙椴茎尖在添加不同浓度的6-BA、NAA培养基中的增殖情况

表3 蒙椴茎尖在不同浓度的BA、ZT培养基中的增殖情况

2.3 继代周期对蒙椴组培继代繁殖的影响

蒙椴组培苗在继代培养后，试验统计了4个不同继代周期对蒙椴继代苗繁殖系数、生长状态的影响（表4）。观察发现继代周期25d时，茎段基部无褐化，继代腋芽萌发率达89.12%，繁殖系数达2.72；继代周期30d时，基部无褐化但有轻度玻璃化现象，继代腋芽萌发率达91.24%，繁殖系数达6.38；继代周期35d时，基部出现轻度褐化和轻度玻璃化现象，继代萌发率达79.06%，繁殖系数达4.58；继代周期40d时（CK），基部褐化严重且伴有重度玻璃化现象，继代萌发率达64.17%，2周期繁殖系数达3.02。从表4中数据可以看出：缩短继代时间可以有效防止蒙椴继代苗褐化和玻璃化现象，提高萌发率。其中，30d和35d继代周期下的繁殖系数分别是对照的2.11倍和1.52倍，通过提高腋芽萌发率显著提高了繁殖系数。25d继代周期下的继代苗虽然萌发率较高，且基部无褐化，但由于生长期太短、腋芽数少，繁殖系数较低。

表4 继代周期对蒙椴组培继代繁殖的影响

2.4 pH值对蒙椴增殖的影响

蒙椴幼苗喜欢微酸性的土壤，所以在组培过程中，对培养基pH值也进行了调整。研究发现：培养基的pH值对蒙椴腋芽增殖系数的影响显著（表5）。在各处理之间，增殖系数差异显著。培养基pH值为5.6的腋芽增殖系数最低，为1.5；pH值为5.8的处理次之，增殖系数为2.3；当培养基pH值为6.0时，腋芽增殖系数最高，为5.4；pH值为6.2时，增殖系数下降，为4.3。培养基pH值为6.0处理的增殖系数是pH值为5.6处理的3.6倍。从生长状态上来看，当培养基pH值在6.0～6.2之间时，生长情况良好，新增生的腋芽比较健壮，叶片较大。当pH值为5.6时，培养基呈酸性，幼芽长得比较细弱，增殖系数明显下降。因此，在蒙椴腋芽增殖培养中，pH6.0～6.2的微酸性培养基更适合腋芽的增殖培养。

表5 pH值对蒙椴腋芽分化的影响

3 结论与讨论

本研究发现，蒙椴在诱导阶段不同的基本培养基影响很大，WPM培养基比较适合蒙椴的诱导培养。诱导阶段对BA与NAA的适量范围相对较宽，一般都能诱导腋芽萌发；在增殖阶段，增殖系数随着BA浓度的增加而提高，NAA浓度为0.05mg/L时，其增值系数较低，分化情况不好，植株生长迟缓。BA与NAA的适量配合使用才能够达到诱导腋芽分化的目的。本试验表明：WPM培养基附加BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+GA32.0mg/L的配比的外植体分化最好。由于蒙椴生性属于较耐荫树种，喜微酸性土壤，根据这样的特性，蒙椴腋芽离体快繁在偏酸性的培养基上诱导效果好，这也符合蒙椴的生长特性。

通过试验发现，蒙椴在当地气候6月份间，枝条抽叶进入了加快的阶段，植物体内各种营养物质比较活跃，而且枝条还没有进入木质化阶段，这个时期接种进行组织培养是最合适的。植物激素组合不同配比对植物组织培养增殖效果有很大不同[10-14]。本研究中，添加细胞分裂素与生长素的浓度与比例在不同品种椴树中并不相同，可能与树种差异有关。细胞分裂素与生长素比例不适合，外植体不分化，腋芽有轻微膨胀的现象，且长时间不会发生进一步的变化，说明生长素与细胞分裂素的配合使用是必要的。