UPLC-MS/MS测定14-羟基芸苔素甾醇

王菲迪，王莉，吴声敢，蒋金花，柳新菊，安雪花，吕露，赵学平

(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所 省部共建农产品质量安全国家重点实验室(筹)农业农村部农药残留检测重点实验室，浙江 杭州 310021)

14-羟基芸苔素甾醇是一种结构新颖的油菜素甾醇(Brassinosteroid，BRs)激素。BRs是一类多羟基的类固醇植物激素，被誉为继生长素、乙烯、脱落酸、赤霉素、细胞分裂素后的第六类植物内源性激素[1]。BRs能够调节植物生长发育，具有高效、广谱、无毒的特点，在农业生产中应用广泛[1]。14-羟基芸苔素甾醇制备时主要以花粉为原料，采用酶法水解萃取进行提取、分离和纯化，具有良好的芸苔素内酯活性[1]。14-羟基芸苔素甾醇分子式为C27H46O7，化学名称为(20R，22R)-2β，3β，14，20，22，25-六羟基-5β-6-酮。包括14-羟基芸苔素甾醇在内的BRs分子中缺乏对光、电高响应的官能团，且挥发性差，较难离子化[2]。检测时，最常见的思路是利用甾醇分子中特征的顺式邻二羟基与烃基硼酸结合，引入生色团或电活性基团，再利用质谱、紫外、荧光或电化学检测器进行检测[2]。衍生化操作繁琐，不经衍生化直接用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)可对14-羟基芸苔素甾醇直接进行检测。吴进龙等[3]以萘硼酸为衍生化试剂，以甲醇为溶剂进行衍生化反应，采用HPLC-DAD对衍生化产物进行检测，此法定量限(LOQ)为25.0 mg·L-1。其团队还采用HPLC-ELSD对14-羟基芸苔素甾醇直接进行检测，LOQ为16.1 mg·L-1[4]。根据报道，其他种类芸苔素甾醇的分析方法也通常着眼于生物检测、衍生化分析和免疫分析等手段，但生物检测稳定性差，难以准确定量，衍生化方法操作繁琐，免疫分析成本高，且高度转移[2]。而超高效液相色谱-串联质谱分析方法(UPLC-MS/MS)具有高效、分离度高、灵敏度高等特点，是芸苔素甾醇检测技术发展的一个趋势。本研究通过UPLC-MS/MS，建立更灵敏、选择性更高的分析方法，旨在为芸苔素甾醇的分析检测提供一定的研究思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ABSciex液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪(Exion LCAD-Triple QuadTM 5500，美国ABSciex公司)；CORTECS®UPLC®HILIC色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美国Waters公司)；BSA224S 电子天平(感量0.000 1 g，德国赛多利斯集团)；MX-S可调式混匀仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)。

14-羟基芸苔素甾醇标准品(纯度99.0%，成都新朝阳作物科学有限公司)；色谱纯乙腈(德国Merck公司)；色谱纯甲酸和色谱纯乙酸铵(Anaqua Chemicals Supply公司)；饮用纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.2 标准溶液配制

准确称取适量14-羟基芸苔素甾醇标准品，用乙腈溶解，配成浓度为1.19×103mg·L-1的标准储备液，再用乙腈逐级稀释，得到浓度为10.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010和0.005 mg·L-1的标准工作液。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

取5.0 mL水样，加入5.0 mL乙腈，涡旋1 min混匀。用乙腈将混匀后的溶液稀释5倍，过0.22 μm滤膜，待分析。

1.3.2 检测条件

液相条件。色谱柱CORTECS®UPLC®HILIC色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美国Waters公司)。流动相：A为0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：起始比例A为5%；0～0.5 min，A维持5%；0～0.5 min，A升至30%，然后维持至3.5 min；3.5～4.0 min，恢复至起始梯度平衡系统，维持至6.0 min。流速0.25 mL·min-1；柱温40 ℃；进样体积5.00 μL；峰面积外标法定量。

质谱条件。毛细管电压-4.5 kV，气帘气35 psi，喷撞气7 psi，喷雾气50 psi，辅助加热气50 psi，离子源温度550 ℃，射入电压-10 V，碰撞室射出电压-16 V。定性、定量模式均为MRM多反应监测模式，电离方式为ESI-。14-羟基芸苔素甾醇的定量离子对(去簇电压、碰撞能)为m/z541.2>159.2(-100 V，-40 V)，定性离子对(去簇电压、碰撞能)为m/z541.2>347.5(-100 V，-36 V)。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

14-羟基芸苔素甾醇分子中缺乏对光、电高响应的官能团，较难离子化，因此质谱检测时母离子和子离子的确定很困难。分别在ESI+和ESI-两种电离方式下对14-羟基芸苔素甾醇的母离子进行扫描，最终确认母离子为[M+CH3COO-]的离子，常见的[M+H+]和[M+Na+]等信号均较弱，然后确定子离子，优化了碰撞能量、去簇电压等参数。

2.2 色谱条件的优化

分别考察ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱、CORTECS®UPLC®HILIC色谱柱及ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱对14-羟基芸苔素甾醇的分离分析性能。14-羟基芸苔素甾醇极性较大，在ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱和ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱上基本无保留，1 min内就出峰，且稳定性差，故最终选择适合分离分析极性化合物的CORTECS®UPLC®HILIC色谱柱。

考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液、乙腈-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液及甲醇-2 mmol·L-1乙酸铵水溶液等流动相对14-羟基芸苔素甾醇的色谱峰形和响应值的影响。最终确定流动相为乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液，在该流动相体系下，色谱峰形相对较好且稳定。

2.3 前处理方法的优化

分别采用了乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取、乙腈提取和乙腈定容的方法进行了添加回收试验。结果表明，乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取和乙腈提取方法的回收率均较低，未能满足农药检测要求，而乙腈定容后再稀释的方法的添加回收率满足检测要求。因此，最终选择了乙腈定容的前处理方法对14-羟基芸苔素甾醇进行检测。

2.4 方法的线性范围

将0.005、0.010、0.050、0.100和0.200 mg·L-1的14-羟基芸苔素甾醇标准工作溶液进仪器进行检测。以浓度为横坐标，分别对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线，计算回归方程和相关系数，得到回归方程为y=279 012x+1 521，相关系数R2=0.992 7，表明14-羟基芸苔素甾醇在0.005～0.200 mg·L-1浓度线性良好。

2.5 方法的准确度、精密度和定量限

在不含14-羟基芸苔素甾醇的空白水样中，通过添加回收试验，考察了方法的准确度和精密度(n=5)。表1表明，14-羟基芸苔素甾醇在0.1、1.0、11.9 mg·L-1添加水平下，平均回收率在101%～106%，相对标准偏差在3.29%～5.82%，满足检测分析的要求。根据添加回收，确定14-羟基芸苔素甾醇的定量限(LOQ)为0.1 mg·L-1。

表1 14-羟基芸苔素甾醇的添加回收率和相对标准偏差

3 小结

本研究建立了14-羟基芸苔素甾醇的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，该方法简单、快速、高效、灵敏，检出限最低可到0.1 mg·L-1，能够满足14-羟基芸苔素甾醇残留量的检测要求，为芸苔素甾醇的分析方法提供了一定的研究思路。但今后仍需发展更为灵敏的检测方法，如发展操作简易、响应灵敏的新型衍生化试剂，与液相色谱-串联质谱相结合，为芸苔素甾醇这类新型植物生长调节剂的风险监控提供强有力的支持。