健脾消积方水提物对人肝癌SMMC7721细胞自噬的调控机制

韩志伟， 王宗玉， 鞠佳霓， 李科志， 邬国斌， 林栋毅， 陈 闯

1 广西医科大学附属肿瘤医院， 南宁 530021； 2 中山大学孙逸仙纪念医院， 广州 510030

原发性肝癌中，肝细胞癌是最常见的类型，在世界范围内，肝细胞癌是第六大最常见的恶性肿瘤和第三大最常见的癌症死亡原因[1]，肝癌复发率高，预后差，严重威胁人类健康。现阶段肝癌治疗方法以手术切除肿瘤、介入治疗、全身治疗和化疗为主[2]。对于晚期多处转移的患者多采用放射治疗和化学药物治疗。然而耐药性和不良反应限制了化学药物的应用。中药具有整体性、多靶点和相互协同的干预作用, 对慢性复杂性疾病具有改善预后、不良反应轻等优势，成为治疗肝癌的理想候选药物[3]。

健脾消积方由太子参、黄芪、白花蛇舌草、太子参等中药组成[4]。临床上主要用于“肝郁脾虚”证肝癌患者的防治，具有稳定瘤体、延长生存时间、改善患者生存质量等作用，是体现“健脾理气”法防治肝癌的方剂之一[5]。本课题组前期研究发现该方对肝癌细胞有较明显的增殖抑制作用[6]，其机制尚不明确。

细胞自噬与肿瘤的发生发展有着密切联系，起着促进和抑制的双重作用[7]。中药通过整体和局部作用调控机体内环境，这与自噬维持机体内环境稳态的过程相似[8]。本文将观察健脾消积方水提物对肝癌细胞SMMC7721的增殖、凋亡及自噬的影响，检测自噬流和自噬相关蛋白的变化，为探讨该方对自噬的调控机制提供实验依据。本研究方案经过广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批(批号：LW2019059)。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 胎牛血清FBS(海克隆)；DMEM(康宁)；CellTiter-Glo(普洛麦格)；LC3A/B抗体、Beclin1抗体和P62抗体(CST公司)；Agilent RNA 6000 Nano Kit、Trizol试剂盒(吉凯基因)；TB Green Premix Ex TapⅡ (TAKARA公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(TAKARA公司)；抗兔、抗鼠抗体(赛默飞)；过表达SensGFP-StubRFP-LC3的自噬检测慢病毒(吉凯基因)。

1.1.2 主要仪器 荧光显微镜(奥林巴斯)；倒置显微镜(上海蔡康)；共聚焦显微镜(日本横河)；Thremo Nanodrop 2000 (赛默飞) ；Agilent 2100 (安捷伦) ；Nanodrop 2000(赛默飞)。

1.1.3 复方冻干粉制作 健脾消积方的中药药材均购自广西仙茱中药科技有限公司。采用“正交法”提取该方的水提物，再作成冻干药粉，对该方的提取物有较好的质控标准，以便能对实验结果进行重复。每克健脾消积方冻干粉含生药 8.37 g。取制备好的冻干粉用DMEM培养基配置含药培养液，37 ℃水浴锅溶解，离心后用0.22 μm过滤器过滤除菌，分装,-20 ℃保存备用。

1.1.4 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC7721由广西医科大学附属肿瘤医院中心实验室提供。将人肝癌细胞培养于含10%胎牛血清DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，观察细胞生长状态，1～2 d换液1次，2～3 d用0.25%胰酶消化后传代。

1.2 CCK-8法测定SMMC7721细胞增殖情况 将SMMC7721细胞接种于96孔板，每孔约3000个细胞，设置3个复孔。取适量含药培养液稀释，按测得IC50的浓度配制备用。取1500 μg/ml的含药培养液按照每孔100 μl作用于肝癌SMMC7721细胞，另设空白对照组。加药后24～96 h(每24 h换药1次)后进行CCK-8检测。培养终止前每孔加10 μl CCK-8溶液，酶标仪检测450 nm吸光度值，计算增殖倍数。

1.3 流式细胞学测定SMMC-7721细胞的凋亡 取SMMC-7721 细胞，给予终浓度为1500 μg/ml的含药培养液，对照组加相同体积的培养基；于培养箱内继续培养48 h，检测第5天的凋亡率。细胞消化洗涤后，加入 1×binding buffer 洗涤细胞沉淀1次，再加入200 μl 1×binding buffer 重悬细胞沉淀，将细胞转移到2 ml EP管中。充分混匀后，分别加入10 μlAnnexin V-APC 染色和5 μl Propidium Iodide并混匀，最后以滤网过滤各组样品，并转至新的流式管内，避光反应半小时后，15 min内上机检测。使用流式细胞仪分析软件Guava InCyte进行结果分析。

1.4 Western Blot检测Beclin1、 LC3和p62蛋白的表达 取适量含药培养液按1500 μg/ml、2100 μg/ml的浓度稀释，设对照组。细胞加药处理48 h，收集细胞悬液，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。各孔加入20 μg 蛋白样品，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到 PVDF 膜，50 g/L脱脂奶粉封闭 2 h。4 ℃孵育Beclin1、LC3、p62抗体过夜。次日室温孵育二抗 1 h后用TBST 洗涤3次，用化学发光法显影曝光，图片经 Image lab 软件分析灰度值。

1.5 SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒转染SMMC7721细胞检测自噬流 将构建好的SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒转染SMMC7721细胞，转染24 h后,连续3 d使用嘌呤霉素(2 μg/ml)筛选未感染细胞并清除。之后将细胞接种至96孔板中(4000个/孔，每组3复孔)。次日待细胞贴壁后，加入适量1500 μg/ml的含药培养液，另设空白对照组。待药物干预细胞48 h后，加入Hochest对细胞核进行染色，并立即置于CQ1中使用SensGFP、StubRFP和Hochest三通道进行扫板，采用CQ1的“two colour dots in cellbody”模式进行数据分析。

2 结果

2.1 健脾消积方水提物抑制肝癌SMMC7721细胞增殖

健脾消积方水提物干预SMMC7721细胞达到半数抑制的浓度约为1500 μg/ml，分别干预肝癌SMMC7721细胞24 h、48 h、72 h、96 h后，结果显示，健脾消积方水提物抑制肝癌SMMC7721细胞增殖，加药干预后不同时间细胞增殖倍数与对照组相比差异均有统计学意义(P值均<0.001)(表1)。

2.2 健脾消积方显著促进SMMC7721细胞的凋亡 与对照组(1.74%±0.07%)相比，加药组细胞的凋亡(14.83%±0.53%)明显升高，活细胞比率明显减少，差异有统计学意义(t=-42.629，P<0.001)。

2.3 自噬相关蛋白表达的检测结果 检测结果见图1。

表1 健脾消积方水提物对SMMC7721细胞增殖的影响

图1各组肝癌SMMC7721细胞Beclin1、LC3和p62蛋白表达的电泳图

加药组Beclin1的表达明显下调，Beclin1作用于自噬的上游，对调控自噬具有重要作用，Beclin1的下调表明细胞的自噬过程可能受到了抑制。LC3I变化趋势不明显，LC3Ⅱ的表达随剂量增加而升高，并且LC3Ⅱ的表达明显高于同一样品LC3I水平，提示加药组细胞可能促进LC3I向LC3Ⅱ的转化。LC3Ⅱ由LC3I酯化后形成并聚集在自噬体膜上，其含量与自噬体的数量成正比，是自噬体生成的标志性蛋白[9]。因此，LC3Ⅱ表达量的提高提示自噬小体增多[10]，提示健脾消积方水提物促进了SMMC7721细胞自噬体的生成。不同浓度健脾消积方水提物培养液组p62基因的蛋白表达量与溶剂对照组相比有所上升。p62是自噬体降解的底物之一，p62经过泛素化蛋白修饰后与自噬体结合形成自噬流[11-12]，并在自噬体和溶酶体结合形成自噬溶酶体后被降解清除[13-14]。本研究中p62蛋白表达水平增高提示健脾消积方可能阻滞了SMMC7721细胞的自噬流。

2.4 健脾消积方水提物SMMC7721细胞自噬流的检测

随着自噬的发生，LC3带动SensGFP和StubRFP荧光蛋白聚集在自噬相关的双层膜结构中，并在共聚焦显微镜下形成荧光点。在自噬体对应的荧光点中，SensGFP和StubRFP各自发出绿色和红色的荧光。在自噬溶酶体对应的荧光点中，虽然SensGFP、StubRFP和LC3均存在，但由于SensGFP在酸性环境中荧光易淬灭，因此仅存在StubRFP发出的红色荧光[15-17]。细胞中红色荧光点的数目代表自噬体和自噬溶酶体的总数量，绿色荧光点的数目代表自噬体的数量，两者的相对数量代表自噬流从自噬体到自噬溶酶体的流动速度。与对照组相比，加药组(1500 μg/ml和2100 μg/ml组)的红色荧光点和绿色荧光点明显增多(P值均<0.05)。合并图像中，黄斑点均显著增加，呈现红色的自由红色斑点减少 (图2)。相比对照组组，两个加药干预组红色荧光/绿色荧光相对值显著下降，差异均有统计学意义(P值均<0.001)(表2)。提示健脾消积方药物可能抑制了自噬体向自噬溶酶体的流动。

图2 健脾消积方水提物干预SMMC7721细胞自噬流检测的荧光图像

表2 不同处理组红色荧光/绿色荧光相对表达量

注：与对照组比较，1)P<0.001。

3 讨论

众多研究表明，中草药及其有效成分具有调控细胞自噬水平的抗肿瘤作用，包括通过自噬诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤耐药[18]、调节肿瘤免疫发挥抗肿瘤效应[19-20]。为了探究健脾消积方水提物对肝癌SMMC7721细胞自噬的影响,本研究检测了自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62的表达。

健脾消积方水提物干预细胞后，Beclin1蛋白表达明显下调，表明细胞自噬过程受到了抑制。Beclin1是Bcl-2的同源蛋白，是上游的自噬启动蛋白，和Bcl-2具有相同的BH3结构域，Beclin1不仅可以调控自噬，还可能通过Bcl-2发挥调控凋亡的效应[21]。LC3是自噬体膜上的标志性蛋白，在自噬过程中，胞浆型LC3Ⅰ会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系所修饰和加工，产生膜型 LC3Ⅱ[22]。LC3Ⅱ是检测自噬泡形成的特异性标志性蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值变化可以评价自噬体的形成[23]。实验结果显示，健脾消积方水提物处理肝癌SMMC7721细胞，加药组自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达明显增加，提示健脾消积方水提物可诱导LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ，即自噬体生成增多。p62是检测自噬流活性的标志性蛋白之一，用来评价自噬和自噬流的强弱。细胞自噬过程依赖于溶酶体的功能，p62结合泛素化蛋白进入到自噬体后最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除[5]。本研究中给药组p62表达上调，提示健脾消积方水提物可能抑制了自噬体与溶酶体的结合，阻碍肝癌SMMC7721细胞自噬体的降解和清除。为了分别评估自噬体和自噬溶酶体积累的程度，研究中给细胞转染了包含串联荧光SensGFP-StubRFP-LC3的腺病毒来检测自噬流。检测结果显示48 h后，相比对照组，加药组红色荧光和绿色荧光相对数量下降，即自噬溶酶体减少。证实了健脾消积方水提物阻滞了自噬体向自噬溶酶体的流动。自噬体无法降解导致了自噬体的堆积，而细胞内自噬体的大量堆积最终导致了肝癌SMMC7721细胞的死亡。关于健脾消积方在自噬上游通路如何诱导肝癌细胞自噬，调控细胞自噬性死亡，发挥抗癌效应还需进一步探索。

综上，健脾消积方水提物能够使肝癌SMMC7721细胞Beclin1蛋白表达上调，LC3Ⅱ和p62表达下调，同时阻滞自噬流。其抗肝癌机制可能是通过促进自噬体生成，抑制自噬体溶解，从而使细胞内自噬体大量堆积而导致的细胞死亡。