缺血再灌注条件下内皮祖细胞促进单核/巨噬细胞向M1 型极化的研究

程 华，金梅花，董俭达

1宁夏医科大学总医院心血管内科，宁夏 银川 750000；2宁夏医科大学病理学系，宁夏 银川 750004

随着人民生活水平的提高，我国心血管疾病的发病率和死亡率均显著升高，给社会和家庭带来了极大的负担［1］。血管内支架植入疏通了堵塞的血管，显著改善患者的临床症状，然而血管再通后的缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）会激活单核/巨噬细胞，促进其向损伤部位浸润和释放炎症分子，引起心律失常和心肌细胞进一步损伤等严重后果［2］。因此，调控炎症反应对于治疗I/R 损伤至关重要。炎症反应与血管生成紧密相关，低强度的炎症反应会诱导内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）从骨髓动员［3］。EPC 是内皮细胞的前体干细胞，能归巢到血管损伤部位，促进再内皮化和发挥细胞保护作用［4］。EPC表面则表达有3个促炎分子：细胞间黏附分子⁃1（intercellular adhesion molecule ⁃1，ICAM⁃1）、血管细胞黏附分子⁃1（vascular cell adhe⁃sion molecule⁃1，VCAM⁃1）和E⁃选择素，介导了EPC与单核/巨噬细胞之间的相互作用。然而在I/R条件下，EPC与单核/巨噬细胞相互作用还未见相关报道。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI1640 培养基、胎牛血清、EGM⁃2 完全培养基和胰酶（Hyclone 公司，美国）；人淋巴细胞分离液（天津TBD公司）；CCR7、CD206、CD14磁珠、ICAM⁃1、VCAM⁃1 和E⁃选择素流式检测抗体（BD 公司，美国）；ICAM⁃1、VCAM⁃1、E⁃选择素ELISA 试剂盒（深圳欣博盛生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离和培养

取健康志愿者的外周血，通过梯度离心的方法分离出单个核细胞，一部分细胞置入EGM⁃2 完全培养基中进行培养，连续培养7 d；另一部分细胞采用CD14 磁珠进行分选，PBS 清洗3 次后，将分选的细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中培养。

1.2.2 体外缺血再灌注损伤模型构建

采用文献报道的方法构建I/R 损伤模型［5］。EPC培养7 d后，弃上清，PBS清洗3次。之后加入不含葡萄糖的D⁃Hank's 溶液，将其置于通有95%N2、5% CO2的37 ℃培养箱中缺氧培养3 h。之后更换为正常培养基，置于通有95%O2、5%CO2的培养箱中继续培养24 h，设置为I/R组。

1.2.3 EPC促炎分子检测

EPC I/R 损伤处理24 h 后，用胰酶消化。加入ICAM⁃1、VCAM⁃1 和E⁃选择素流式细胞检测抗体，室温孵育15 min，PBS 清洗3 次后，在流式细胞仪上检测各个分子表达的平均荧光强度（mean fluores⁃cence intensity，MFI）。同时收集细胞培养上清，ELI⁃SA检测上清中ICAM⁃1、VCAM⁃1和E⁃选择素的含量。

1.2.4 细胞共培养实验

采用Transwell 小室进行EPC 和单核/巨噬细胞共培养。EPC培养7 d后，分为5组：对照组（EPC细胞与单核/巨噬细胞共培养）、I/R组（I/R损伤EPC细胞与单核/巨噬细胞共培养）、ICAM⁃1阻断组（I/R 损伤EPC 细胞与单核/巨噬细胞共培养，同时加入ICAM⁃1 中和抗体）、VCAM⁃1 阻断组（I/R 损伤EPC细胞与单核/巨噬细胞共培养，同时加入VCAM⁃1中和抗体）和E⁃选择素阻断组（I/R 损伤EPC 细胞与单核/巨噬细胞共培养，同时加入E⁃选择素中和抗体）。共培养48 h 后，收集上室的单核/巨噬细胞，加入CCR7 和CD206 流式细胞检测抗体，室温孵育15 min，PBS 清洗3 次后，在流式细胞仪上检测CD14+CCR7+M1单核/巨噬细胞和CD14+CD206+M2单核/巨噬细胞比例。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0 进行数据分析，结果用均数±标准误（）表示，两组之间的比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注条件下EPC细胞表面促炎分子E⁃选择素表达增加

流式细胞术检测结果显示对照组EPC 表面ICAM⁃1 和VCAM⁃1 平均荧光强度分别为1 214 和3.380，I/R 组为1 282 和5.023，两组之间没有显著的统计学差异（t=0.354，P=0.742；t=1.322，P=0.257）；对照组EPC 表面E⁃选择素平均荧光强度为10.89，缺血再灌注组为33.93，两组之间具有显著的统计学差异（t=3.895，P=0.018，图1）。

2.2 缺血再灌注条件下EPC 促炎分子E⁃选择素分泌增加

ELISA 检测结果（图2）显示对照组EPC 上清中ICAM⁃1 和VCAM⁃1 浓度分别为178.0、0.740 ng/mL，I/R 组为199.3、0.903 ng/mL，两组之间没有显著的统计学差异（t=0.518，P=0.632；t=0.409，P=0.704）；对照组EPC 上清中E⁃选择素浓度为3.69 ng/mL，I/R 组为18.17 ng/mL，两组之间具有显著的统计学差异（t=4.568，P=0.010）。

2.3 缺血再灌注条件下EPC促进单核/巨噬细胞向M1型极化

流式细胞术检测结果（图3）显示对照组CD14+CCR7+M1 型单核/巨噬细胞比例为58.83%，I/R 组为81.43%，两组之间具有显著的统计学差异（t=5.394，P=0.006）；ICAM⁃1 阻断组和VCAM⁃1 阻断组M1 型单核/巨噬细胞比例分别为79.10%和76.93%，相对于I/R 组，没有显著的统计学差异（t=0.531，P=0.622；t=1.061，P=0.348）；E⁃选择素阻断组M1 型单核/巨噬细胞比例为59.70%，相对于I/R 组，结果具有显著的统计学差异（t=5.950，P=0.004）。

2.4 缺血再灌注条件下EPC 抑制单核/巨噬细胞向M2型极化

流式细胞术检测结果（图4）显示对照组CD14+CD206+M2型单核/巨噬细胞比例为60.57%，I/R组为35.30%，两组之间具有显著的统计学差异（t=6.424，P=0.003）；ICAM⁃1 阻断组和VCAM⁃1 阻断组M2 型单核/巨噬细胞比例分别为42.47%和42.03%，相对于I/R 组，没有显著的统计学差异（t=2.676，P=0.055；t=1.838，P=0.140）；E⁃选择素阻断组M2 型单核/巨噬细胞比例为59.07%，相对于I/R 组，结果具有显著的统计学差异（t=4.179，P=0.014）。

3 讨论

心血管疾病是威胁我国人民生命和健康的最大杀手，据统计目前我国心血管疾病患病人数近3亿，死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上。近十年，药物洗脱支架在临床广泛应用，使得很多患者能够得到及时救治，显著缓解其临床症状［6］。然而血管再通后的I/R 损伤会释放大量的氧自由基，损伤的细胞则会释放大量的炎症分子，诱导单核/巨噬细胞向I/R 损伤部分浸润［7］。单核/巨噬细胞分为M1型和M2型2种，M1型为促炎型单核/巨噬细胞，能够分泌大量的炎症分子，包括肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）和IL⁃6等，这些升高的炎症分子能够损伤血管内皮细胞，加剧炎症反应；M2 型为组织修复型单核/巨噬细胞，能够分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转化生长因子⁃β（transforming growth factor，TGF⁃β）等，促进组织损伤的修复和血管生成［8］。本研究发现在I/R条件下，EPC 能够促进单核/巨噬细胞向M1 型极化，引起缺血组织的进一步损伤，这为I/R 损伤提供了一个新的机制。

炎症反应与血管生成紧密相关，EPC和单核/巨噬细胞之间相互作用。低强度的炎症反应能够诱导血管生成，过度或者持续的炎症反应则会损伤血管内皮细胞［9］。M2 型单核/巨噬细胞能够分泌大量促血管生成分子，比如VEGF 和TGF⁃β等。通过诱导单核/巨噬细胞向M2型极化能够促进损伤血管内皮细胞层的修复和组织的再生修复［10］。EPC表面则表达有3个促炎分子：ICAM⁃1、VCAM⁃1和E⁃选择素，介导了EPC与单核/巨噬细胞之间的相互作用［11］。本研究发现在I/R 损伤条件下，E⁃选择素表达和分泌会显著升高，而ICAM⁃1和VCAM⁃1 则没有显著的差异。在损伤的情况下，内皮细胞会高表达和大量分泌E⁃选择素进入外周血，诱导动脉粥样硬化的发生［11］。本研究发现EPC能够通过高表达和分泌E⁃选择素，促进单核/巨噬细胞向M1 型极化，加剧局部的炎症反应，这说明I/R 条件下，EPC 和单核/巨噬细胞之间的相互作用是通过E⁃选择素来介导的。因此，在I/R 损伤治疗中，应该注意调控EPC 表面E⁃选择素的表达。

综上，本研究发现在I/R 损伤条件下，EPC 能够通过高表达和分泌E⁃选择素，促进单核/巨噬细胞向M1型极化，为I/R损伤的治疗提供了新靶点。