红叶石楠提取类胡萝卜素的工艺条件研究

蒋耀瑛 霍湘芸 董子钰

摘要：在单因素试验基础上，采用正交试验优化红叶石楠绿叶中类胡萝卜素的提取工艺条件，并用柱层析分离纯化粗提液中的类胡萝卜素。结果表明，在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1为提取剂，料液比1∶10，浸提时间1.5 h，类胡萝卜素含量可达51.26 μg/g。该类胡萝卜素粗提液经过柱层析法初步分离纯化，纯化倍数可达1.41。

关键词：红叶石楠;类胡萝卜素;提取;纯化;柱层析

中图分类号：TS201.2     文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.009

Abstract：On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment was used to optimize the extraction conditions of carotenoids from Photinia fraseri，and then the carotenoids in the crude extract were separated and purified by column chromatography. The results showed that the extraction rate of carotenoids could reach the maximum of 51.26 μg/g when acetone∶ethanol=1∶1 was used as extractant at 40 ℃，and the ratio of material to liquid was 1∶10 for 1.5 h. In addition，the preliminary exploration of purification and separation of carotenoid crude extract was also carried out. The purification multiple can reach 1.41.

Key words：Photinia fraseri;carotenoids;extraction;purification;column chromatography

类胡萝卜素是所有光合生物及一些非光合原核生物与真菌合成的亲脂性天然色素，对植物、动物和人都具有广泛的生物学作用[1]。有些类胡萝卜素可以作为维生素A的前体来改善视力，还有清除自由基、延缓衰老、增强免疫功能等多种功效。另外，也可以作为食品、化妆品的天然着色剂。随着对类胡萝卜素需求的日益增加，综合开发利用植物類胡萝卜素已成为迫切需求。据报道，已有研究从作为观赏植物的红叶石楠叶中提取出了黄酮类化合物、绿色素类[2]、熊果酸[3]、齐墩果酸[4]，但还鲜有提取类胡萝卜素的报道。对红叶石楠绿叶中类胡萝卜素的提取及分离纯化工艺进行初步研究，以期为红叶石楠绿叶中类胡萝卜素的有效开发应用提供参考。

1   材料与方法

1.1   材料与仪器

石楠叶，新鲜红叶石楠绿叶片，2018年4月采摘于中国药科大学江宁校区食堂门口。选择颜色明艳、大小均匀、形状完整的叶片，洗净沥干水分后，于烘箱内40 ℃下烘干，恒质量后真空干燥1 h，然后粉碎、过100目筛，避光保存。

主要试剂：丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、无水乙醇、β-胡萝卜素、氧化铝、硅藻土等，均为分析纯试剂;柱层析硅胶，100～200目。

主要仪器：DFY-500型高速中药粉碎机、DZF- 6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外-可见分光光度计、HH-8型数显恒温水浴锅、TGL-16G型高速台式离心机等。

1.2   类胡萝卜素的提取

准确称取1 g红叶石楠绿叶粉末，以一定料液比加入提取溶剂，在一定温度下提取一定时间，离心得上层清液即为粗提液。

（1）料液比的影响。丙酮为溶剂，分别称取1.0 g粉末于试管中，温度40 ℃，料液比1∶10，1∶15， 1∶20，1∶25，1∶30条件下暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。

（2）提取时间的影响。以丙酮为溶剂，分别称取1.0 g粉末于试管中，提取温度40 ℃，料液比 1∶20，暗处水浴密封提取1.0，1.5，2.0，2.5 h。于波长 450 nm处测定吸光度。

（3）提取溶剂的影响。选用无水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚（1∶2），丙酮∶石油醚（3∶7），丙酮∶乙醇（1∶1）为溶剂，分别称取1.0 g粉末于试管中，料液比 1∶20，温度40 ℃，暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。

（4）提取温度的影响。丙酮为溶剂，分别称取1.0 g粉末于试管中，料液比 1∶20，分别在温度30，35，40，45，50 ℃下暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。

（5）正交试验。红叶石楠叶类胡萝卜素分离的正交试验采用四因素三水平L9（34）的设计方法。

提取正交试验的因素与水平设计见表1。

1.3   类胡萝卜素的分离纯化

选用一定的吸附剂和洗脱剂湿法装柱，加入     1 mL类胡萝卜素粗提液，用一定洗脱剂进行洗脱，收集色素液，于波长450 nm处测定吸光度。

（1）吸附剂的选择。分别称取15 g硅胶、硅藻土、氧化铝、硅胶∶硅藻土= 1∶1吸附剂，湿法装柱，加入1 mL类胡萝卜素粗提液，用洗脱剂（石油醚∶丙酮= 2∶1）进行洗脱，收集色素液，于波长450 nm处测定吸光度。

（2）吸附剂质量的选择。分别称取10.0，15.0， 17.5，20.0，25.0 g的硅胶，用洗脱剂（石油醚∶丙酮= 2∶1）湿法装柱，进行洗脱，收集色素液，于波长450 nm处测定吸光度。

（3）洗脱剂的选择。称取5份15 g硅胶，分别用洗脱剂（石油醚∶丙酮= 4∶1，10∶3，7∶3，2∶ 1，5∶3）湿法装柱，加入1 mL类胡萝卜素粗提液，洗脱，收集色素液，于波长450 nm处测定吸光度。

1.4   类胡萝卜素含量的测定

于波长450 nm下测粗提液的吸光度，根据β-胡萝卜素标准品绘制的标准曲线计算类胡萝卜素含量。

Y=0.073 6X+0.002 7，Y为吸光度，X为质量浓度（μg/mL）。

1.5   类胡萝卜素的定性分析

采用1.3中最佳纯化条件下的分离色素液，用纯丙酮作对照，于波长300～700 nm处进行紫外光谱扫描分析。

2   结果与分析

2.1   红叶石楠类胡萝卜素的提取

料液比对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图1，提取时间对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图2，提取溶剂对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图3，提取温度对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图4。

从图1可知，在料液比1∶10时，类胡萝卜素总含量最高，提取效果最好。由圖2可知，随着提取时间增加，类胡萝卜素含量提高，超过2 h后，类胡萝卜素含量逐渐减少。由图3可知，最佳提取溶剂为丙酮，此时类胡萝卜素含量达最大值，类胡萝卜素提取效果最佳。由图4可知，提取温度在40 ℃时，类胡萝卜素总含量最高，提取效果最好。

L9（34）提取正交试验结果见表2。

由表2可知，各因素影响大小依次为料液比>提取温度>提取时间>提取溶剂，最优理论条件组合是A1B3C2D2，通过试验验证，此结果提取效果最佳，类胡萝卜素含量平均值为51.40 μg/g，但跟表2中最高提取组合A1B2C2D2中类胡萝卜素含量51.26 μg/g差距不大，考虑到经济效益，因此选择在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1为提取剂，料液比1∶10，浸提时间1.5 h为最佳提取方案。

2.2   红叶石楠类胡萝卜素的分离纯化

吸附剂种类对类胡萝卜素含量的影响见图5，吸附剂质量对类胡萝卜素含量的影响见图6，洗脱剂种类对类胡萝卜素含量的影响见图7。

由图5可知，当吸附剂为硅胶时，类胡萝卜素含量达到最大值，分离纯化效果最佳。由图6可知，吸附剂硅胶质量为20 g时，分离纯化效果最好。由图7可知，当洗脱剂为石油醚∶丙酮= 10∶3时，分离纯化效果最好。

由于硅胶外的其他吸附剂分离纯化效果不佳，因此不再进行正交试验获取最佳纯化方案，由吸附剂质量及洗脱剂种类试验，纯化倍数最高的方案是20 g硅胶作为吸附剂，石油醚∶丙酮= 2∶1作为洗脱剂，测得样品类胡萝卜素质量浓度为7.22 μg/mL。此时纯化倍数= 7.22/5.13 = 1.41，式中5.13和7.22分别为纯化前后样品中类胡萝卜素的质量浓度。

2.3   红叶石楠类胡萝卜素紫外吸收光谱图

分离的类胡萝卜素吸收光谱图见图8，β -胡萝卜素吸收光谱图见图9。

由图8可知，红叶石楠绿叶中分离的类胡萝卜素具有类胡萝卜素的3个吸收峰的光谱特征，与图9进行对比，更能看出分离色素的最大吸收波长和精细结构与β -胡萝卜素较吻合[5]。

3   结论

从红叶石楠绿叶中提取类胡萝卜素的最佳工艺条件为在40 ℃下以丙酮∶乙醇= 1∶1为提取剂，料液比1∶10，浸提时间1.5 h，其类胡萝卜素提取率平均值可达51.26 μg/g，具有一定的可行性和应用前景，值得进一步探索研究。

参考文献：

何卿，孙国峰，林秦文，等. 植物类胡萝卜素提取与分析技术研究进展[J]. 植物学报，2018，53（5）：700-709.

卫强，张国升，刘金旗，等. 石楠叶红、绿色素成分比较及抗氧化活性研究[J]. 化学研究与应用，2014，26（12）：1 881-1 886.

崔俊凤，张海霞，王春检. HPLC法测定不同地区石楠叶中熊果酸的含量[J]. 解放军药学学报，2012，28（4）：350-352.

罗晓清，祝玮，钱苏生. RP-HPLC法测定石楠叶中熊果酸和齐墩果酸的含量[J]. 现代中药研究与实践，2003， 17（5）：14-15.

储大燕. 烟草中类胡萝卜素及其异构体的分析研究[D]. 合肥：中国科学技术大学，2009. ◇