抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的中药化学成分虚拟筛选△

雷蕾，杨策，亢力，邢雁辉，武红莉，王忠*

1.中国中医科学院 中医药信息研究所，北京 100700；2.中国中医科学院 中医临床基础医学研究所，北京 100700

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus，MRSA)是多药耐药性感染的最常见原因之一，具有显著的发病率和病死率，已成为医院感染和社区获得性感染的重要病原菌之一[1]。随着MRSA对所有种类的抗生素逐渐产生耐药性，它变得越来越难以控制。因此，笔者们一直在寻找新的药物来对抗MRSA。

中医药是我国医学瑰宝，随着中医药现代化发展，越来越多的中药化学成分被分离出来，为新药开发提供了宝贵的资源。已经有很多从天然产物中开发出新药的例子，例如青蒿素的开发[2]和长春碱的开发[3]。然而，传统生物测定筛选的成本高昂。近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。它是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物筛选的方法，可以有效地在进行传统生物学测定之前进行虚拟筛选，从而降低新药开发的成本，并提高命中率。

本研究收集了文献中有抗菌或者抑菌报道的中药以及中药包含的化学成分，希望筛选出可能具有抗MRSA的化合物。因此，使用分子对接的方法对283味中药中包含的6193个化学成分与常见MRSA抑制靶标青霉素结合蛋白2a(PBP2a)进行了分子对接，得到的研究结果希望能给新药开发人员以有价值的参考。

1 资料与方法

1.1 平台和软件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 2007操作系统中完成，采用Accelrys 公司的Discovery Studio 4.5(DS4.5)软件。参数设置除特殊指明，均为默认值。本研究使用的是CDOCKER程序，是基于CHARMm的柔性对接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation将配体分子与受体活性位点进行对接。首先采用动力学的方法随机搜索小分子构象，随后采用模拟退火的方法将各个构象在受体活性位点区域进行优化，从而使对接结果更加准确。分子的吸收、分布、代谢、排泄、毒性(ADMET)计算也是使用DS4.5完成的。

1.2 受体的准备

PBP2a的3D结构(PDB ID：3ZG0，2.60 Å)从Protein Data Bank网站下载(https：//www.rcsb.org/)。MRSA具有多重耐药性，其产生机制是PBPs改变的结果，高度耐药性是由于原有的PBP2与PBP3之间产生一种新的PBP2′(即PBP2a)，低、中度耐药是PBPs的产量增多或与甲氧西林等亲和力下降所致。

PBP2a晶体学研究给出了抑制剂与蛋白在变构位点和活性位点相互作用的信息，变构结合域位于距离dd-转肽酶活性位点60 Å的位置。当配体在变构位点占用时，多残留构象变化在活性位点达到顶峰，从而允许抑制剂进入[4]。3ZG0是蛋白与2个分子的ceftaroline(头孢洛林)共结晶体，配体ceftaroline(ID：1W8)成功触发了PBP2a构象变化，使蛋白的活性部位可以与另一个ceftaroline分子(ID：AI8)结合。ceftaroline是FDA批准的抗MRSAβ-内酰胺抗生素。目前3ZG0已经用于抗MRSA药物的虚拟筛选[5-6]。

本研究受体的准备和结合口袋的定义为删除水分子、原配体分子及其非相关的蛋白质构象，经clean protein工具处理，再加CHARMm力场进行能量优化，定义蛋白为受体，以它的原配体位置为中心，选择半径0.50 nm 范围的残基为活性残基，将其定义sphere球，此范围内的空腔为结合口袋，最后保存备用。

1.3 配体数据的组建

检索中国生物医学文献数据库(SinoMed)、中国期刊全文数据库(CNKI)，万方数据库和维普数据库。检索词有：“抑菌”“抗菌”“药理作用”。时间限制为1949年1月—2017年12月。纳入标准：采集对中药或者中药提取物的药理作用进行研究的文献。排除标准：排除文献研究、综述、非药理实验文献、理论探讨、临床研究、单体成分药理实验报道以及重复报道的文献。数据由人工摘录的方式从文献中收集与中药、中药提取物和药理作用相关的信息。在本研究中，中药提取物统一为中药名称，例如黄芩乙醇提取物规范统一为黄芩，栀子提取物统一为栀子。最后，根据计算系统生物学实验室TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，检索出化学成分。

因为中药常水煎口服，在体内需经吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)以及排泄(excretion)过程，这个过程简称ADME。为了预测化合物ADME的性质，本研究以口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)为条件筛选化合物。将化合物的mol2格式文件导入DS4.5中，首先依据Linpiski规则进行筛选，然后使用small molecules-prepare ligand进一步将配体产生三维结构，加氢，产生异构体等。最后使用small molecules-minimize ligands，加CHARMm力场进行能量最小化，保存为分子对接的配体分子集。

1.4 对接方法可信性验证

含有原配体的蛋白晶体复合结构，将原配体抽离，然后按设定的参数对接回其结合口袋，计算对接后最高打分的构象与原配体结构的均方根偏差值(RMSD)，一般RMSD≤0.20 nm[7]则认为该对接方法可行，说明该套参数能较好地重现此配体与受体的结合模式。

1.5 配体分子与受体靶点对接参数

将上述配体和受体导入DS4.5，调用CDOCKER对接模块，参数均为默认值。

变构位点结合口袋的位置是X=9.965 744，Y=52.253 615，Z=23.244 846，结合口袋的半径为11.520 969 Å。

活性位点结合口袋的位置是X=-35.986 667，Y=44.388 051，Z=66.823 564，结合口袋的半径为12.883 887 Å。

1.6 结果处理

对接完成后，以原配体的对接interaction energy为参考，值高于原配体的予以保留，得到潜在有活性的化合物。

2 结果

2.1 抑菌抗菌中药统计

本研究共检索出252篇文献，一共出现283味中药，其中频次在前10位的见表1。

表1 文献检索频次在前10位的抑菌抗菌中药

2.2 化学成分统计

在283味中药中包含了6193个化学成分，以OB≥30%和类药性DL≥0.18为条件筛选出化合物1137个。进一步使用Linpiski规则筛选出907个化合物。Lipinski规则，即类药五原则(rule of five)，其内容如下：1个小分子药物中要具备以下性质：分子量<500；氢键给体数目<5；氢键受体数目<10；脂水分配系数<5；可旋转键的数量不超过10个。

2.3 可行性验证结果

选取3ZG0含有原配体的复合结构晶体，将原配体抽离，再对接回其结合口袋，计算对接后构象与原配体结构的RMSD 值，<0.2 nm说明该对接方法、所选用的晶体结构及参数的设定可行。

2.4 变构部位分子对接

将原配体ceftaroline对接回变构部位结合口袋，得到interaction energy为-54.89。完成对接后，能量低于它的化合物有66个，结合能最低的10个化合物见表2。

2.5 活性部位分子对接

将原配体ceftaroline对接回活性部位结合口袋，得到interaction energy为-68.65，能量低于它的化合物有6个，见表3。

2.6 作用模式分析

为了研究突变体结构与活性化合物的结合亲和力，进行了作用模式的分析。变构位点在整个对接过程中至关重要，必须先有1个分子与变构位点结合，触发PBP2a构象变化，使蛋白的活性部位可以与另1个分子结合，从而达到抗MRSA的作用。实际上，PBP2a表现出耐药性，是因为在PBP2a的变构位点(146位和150位)上发生了2个氨基酸的变化，这2个氨基酸的变化对头孢类药物产生了抗药性，导致了头孢类药物耐药MRSA菌株的增加[4]。本研究发现了23个化合物与146位氨基酸残基可以通过氢键和范德华力结合。而在3ZG0活性位点上，6个化合物除了范德华力和氢键外，还通过盐桥、ππ相互作用等与周围的蛋白质残基相结合。

本研究发现，不论是变构部位还是活性部位，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt都能以较为稳定的构象与3ZG0结合。syringaresinol diglucoside_qt是syringaresinol diglucoside的去糖基的代谢产物，可以认为是肠道菌水解产物。也就是说，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt就像一把钥匙，1个分子可以先与变构位点结合，触发PBP2a构象变化，使蛋白的活性部位可以与另1个分子结合，从而达到抗MRSA的作用。

表2 变构部位结合能最低的10个化合物

续表2

表3 活性部位结合能低于原配体的化合物

续表3

3 讨论

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对目前所有广谱抗生素都表现出耐药性，对公众构成严重威胁。在中药抗耐药菌的研究中，田应彪等[8]观察了五倍子、黄连、黄柏等16种中药水煎液对MRSA和MSSA体外抑菌作用，黄文玉等[9]发现了大蒜、马齿苋、野菊花等27种清热解毒中药对葡萄球菌耐药菌株的作用，谢大泽等[10]报道了黄连等中药对淋菌耐药菌株体外抗菌活性的研究工作。中药逐渐在耐药菌的研究中崭露头脚，因此本研究希望可以从具有抗菌抑菌作用的中药中寻找到抗MRSA的候选物，进而为新药开发提供参考。

为了能够尽可能地筛选出候选物，在进行虚拟筛选之前，本研究就使用化合物的ADME的性质和Lipinski规则进行了初步筛选。这一方面可以减少分子对接的计算量，另一方面可以保证最后得到的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物。摒除了那些不适合成为药物的分子，缩小筛选的范围，并降低药物研发成本。

PBP2a蛋白结构很特殊，它有一个变构位点，一个活性位点。变构位点就像一扇门，打开了它，活性位点才能有效结合药物分子。本研究发现了66个可以与变构位点良好结合的中药化学成分，它们都可以作为钥匙打开第一扇门。同时发现了6个可以与活性位点良好结合的成分。值得一提的是，不论是变构部位还是活性部位，来自甘草和山豆根的lupiwighteone和来自女贞子的syringaresinol diglucoside_qt都能以较为稳定的构象与3ZG0结合。也就意味着lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt有可能像上市药物ceftaroline一样，以2个分子的形式与PBP2a蛋白相结合，从而达到抗MRSA的目的。