食品包装用纸中酵母菌计数测量不确定度的评定

吕志敏 于 佳 管 宁

（青岛市产品质量检验技术研究所 山东青岛 266101）

1 前言

食品安全是人类健康安全的重要保障，而酵母菌在生长过程中会产生容易引起人类病理变化的次级代谢产物，导致人类急性或慢性中毒，严重的还有可能致癌[1]。通过酵母菌计数来测定食品被污染的程度，可以评价食品卫生质量[2]。酵母菌的数量在一定程度上反映食品包装用纸卫生质量，可用于评价其微生物污染程度。目前，常用的关于食品包装用纸酵母菌总数的检验方法是食品安全国家标准GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母菌总数测定》[3]中的第一法：平板计数法。

2 材料与方法

2.1 材料

本实验所用样品为青岛市地区质量抽查采集的食品包装用纸。

2.2 仪器与试剂

高压灭菌锅；恒温培养箱；电子天平；孟加拉红琼脂；氯化钠。

2.3 检验方法

2.3.1 检验依据

按GB 4789.15—2016中第一法进行检测。

2.3.2 样品制备

无菌条件下，添加质控菌株酿酒酵母ATCC9763菌悬液到酵母菌阴性的食品包装用纸样品中。

无菌条件下，取25 g该样品于225 mL无菌生理盐水中，充分混匀，制成1∶10样品匀液。用1 mL无菌吸管吸取1∶10样液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100样液。依次制备10倍系列稀释样品匀液。

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2.3.3 样品检测

选择2个适宜稀释度的样品匀液，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入2个无菌平皿做空白对照。然后在46℃的孟加拉红琼脂培养基上倾注平皿，并转动使其混合均匀，待琼脂凝固后，将平板正置，28℃培养，观察并记录，培养5d后计数报告结果。

2.3.4 结果计算

用肉眼和低倍镜观察，记录稀释倍数和相应的酵母菌落数（CFU）。选取菌落数在10～150 CFU的平皿用于结果计算。

2.4 不确定度模型

采用整体法评估测量不确定度，以影响测试结果分析程序的总变量为基础进行评估。总变量包括精密度和偏倚，在实际操作中，单位样品的菌落数并不能获得真值，即使使用的材料都经过相关认可，得出的数值也经过了实验室间验证，也只能对总偏倚的部分进行评定。因此，此次实验的测量不确定度的评估不考虑偏倚。

2.4.1 不确定度来源

本实验利用“黑匣子”系统确定实验中不确定度的来源。整体法可看作是一个“黑匣子”系统，食品微生物不确定度的主要来源都可以被标识。它有助于识别不确定度来源，不论其是否包括在实验方案中（图1）。

图1 “黑匣子”系统：食品微生物不确定度主要来源示意

最终，此次实验根据操作员、实验室样品、次级取样、培养基和试剂、操作时间、培养箱等不确定度来源设计实验方案。

其中，次级取样是指从滴加菌悬液的食品包装用纸样品中取出测试的部分，酵母菌计数中的初始悬液属于次级取样。

2.4.2 实验方案

此次实验为实验室内再现性标准偏差，实验将取样的影响并入到总不确定度评估中。排除取样和偏倚，将同一批次的食品包装用纸加入酵母菌菌悬液混合均匀，平均分成10份，操作员A和操作员B同时根据次级取样、培养基、试剂、操作时间、培养箱等不确定度来源进行实验。最终得到各样品的酵母菌菌落总数，采用合并样本标准差的方法进行计算，进而对测量不确定度进行评定。详见图2。

图2 实验室内再现性标准偏差的实验方案

2.4.3 计算公式

依据RB/T 151—2016中要求，合成标准不确定度通过最终测量结果的再现性标准偏差来计算。

本实验的再现性标准偏差为实验室内再现性标准偏差，计算n个给定基质样品的再现性标准偏差SR的方法，按（1）式计算：

其中，SR—再现性标准方差；Yij—对数转换值，单位为log10（CFU/g）；n—给定基质样品数量；i—样品的序号，i=1-n（n≥10）；j—再现性条件的编号，j=A 或 j=B。

扩展不确定度U为合成不确定度uc（y）和包含因子k的乘积，本标准中k值为2（对应95%的置信水平），按式（2）计算：

其中，k—包含因子；U—扩展不确定度；uc（y）—合成标准不确定度；SR—再现性标准方差。

3 结果与分析

平板计数时，用肉眼观察，在记下平板菌落数后，求出各重复平均菌落总数，数据单位从CFU/g转换为 log10（CFU/g）。 详见表 1。

表1 平板计数计算结果

把表1数据带入再现性标准偏差SR，所求再现性标准偏差为：

扩展不确定度为：

U=k×SR=0.24 log10（CFU/g）（置信水平 95%时，包含因子k=2）

此次实验由操作员、次级取样、培养基、试剂、操作时间、培养箱等不确定度来源的不同，分成10组实验，所有实验结果的平均值为6.4 log10CFU/g，lgx=lgx±U，因此，实验结果报告为（6.4±0.24）log10（CFU/g），lgx值区间为6.16 log10～6.64 log10。取反对数后，此次食品包装用纸酵母菌总数的置信区间为1.4×106～4.4×106CFU/g。

4 结论

食品化学样品分析结果常以微量为主，且化学物质具有均一性，有较成熟计算不确定度的方法，而微生物污染的样品分析结果常以宏量为主，测定的是活的物质，不同的菌落之间有互生或拮抗等相互作用，是微生物测量不确定度评定的难点。检验结果报告后，剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检，所以，同一样品多次重复测量的方法并不可取。从统计学上讲，所有被合并计算的检测结果都是在检测重复性或复现性条件下对同一或类似被测对象的重复检测所得到的结果。本文将同一批次的食品包装用纸加入酵母菌菌悬液后混合均匀，平均分成10份，同时进行实验，既避免了同一样品重复测量，又实现了在检测重复性条件下对同一被测对象的重复检测的目的。

随着食品安全问题的焦点化，人们对与食品相关的细菌检测结果的精准度、可信性要求不断提升，引入测量不确定度可以解决对精准度和可信性的要求。在检验时，合理应用测量不确定度的方法，可以更加客观地分析检验数据，为检验结果提供技术支撑。食品包装用纸中酵母菌计数结果引入测量不确定度不仅易于实验室内部质量控制，更能客观分析、评价检测结果，是实验室内部质量控制的一部分，可为检测部门保障食品安全奠定理论技术基础。