食品中植物源性成分的检验技术研究与应用进展

王利刚 费云滟 陈 欣 周正海 黄思瑜 赵 博

（重庆市食品药品检验检测研究院 重庆 401121）

1 前言

随着社会的进步，我国的食品工业发展迅速，市场上可供消费者选择的食品也越来越多。一些生产厂家为了追求更高的经济利益，会在产品中添加一些价格相对低廉的植物源性成分，如核桃饮料中添加大豆、花生等成分[1]，芝麻酱中添加花生、玉米粉[2]，或者在动物源性产品中添加植物源性成分，如羊奶粉中添加大豆成分[3]，这种行为不仅损害了消费者的权利，还可能威胁食用者的身体健康，如果添加的成分中含有对某些食用者的过敏源，则可能导致严重的过敏反应。

对食品中植物源性成分的检验方法多集中于分子生物学方法，其中，聚合酶链式反应（PCR）及其衍生方法应用最为广泛，但是也有学者就蛋白电泳[4]、气相色谱[5]、电子鼻[6]技术等方向进行了相关的探索。本文对广泛使用的PCR及其衍生方法的发展以及其他方法的探索进行综述，以期能为食品中植物源性成分的检验技术的进一步发展提供参考。

2 PCR及其衍生方法

2.1 PCR法

PCR建立于1983年，1988年后PCR在科学界的应用快速发展，可靠性也不断提高，如今在PCR原理的基础上发展出了许多实验方法。PCR是一种核酸体外扩增技术，针对目标序列设计特异性引物，通过控制温度，使反应体系中的Taq酶以目标序列为模板，以dNTP为原料，反复变性、退火、延伸3个步骤，约30个循环即可对目标序列的片段成百万倍的放大[7，8]，通过对扩增产物进行分析，就可以确定是否存在目标成分。

使用PCR法检验食品中的植物源性成分已经发展成熟，对某些特定食品或者整个食品大类的植物源性成分的研究表明，PCR法的特异性、灵敏度、精确度都能达到检验要求，其中某些植物源性成分的检测已经以内源基因等形式存在于植物转基因成分检测、过敏源性成分检验的相关标准中。已有相关地区采用PCR方法作为食品监管风险监测的依据。部分研究者的相关研究成果详见表1。

表1 目标基因、引物相关信息

2.2 实时荧光PCR法

实时荧光 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）是PCR技术的衍生技术，其在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过阈值循环数（Ct值）和标准曲线对起始模板进行分析[19]。RT-PCR相对传统PCR增加了荧光信号，可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类，扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子。如SYBR green I等荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号[20]，扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，目前应用最广泛、最典型的代表就是TaqMan系统，需要设计特异性的荧光探针（表2），两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，当PCR扩增时，探针的荧光基团会被Taq酶的5’-3’外切酶活性切除下来，从而产生荧光[21]。

该技术可对检验结果进行实时跟踪，免去了PCR后进行电泳观察的步骤，还可以对DNA模板进行定量，相对于传统PCR，其灵敏度、特异性和可靠性更高，同时具有自动化程度高、无污染性、具实时性等优点[22]，目前RT-PCR已广泛应用于动植物源性成分检验。RT-PCR法检验植物源性成分以内源基因的形式存在于出入境检验检疫行业标准中，且食品监督管理部门也专门制定并发布了相关的补充检验方法。

2.3 数字PCR法

数字聚合酶链式反应（Digital Polymer-ase Chain Reaction，dPCR）是继普通PCR和RT-PCR之后的第3代PCR技术，是基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量PCR技术。该技术通过微滴化处理或者微孔式芯片将PCR反应液分配到独立的反应室中，理论上每个独立反应室中的目标核酸不超过1拷贝，独立进行荧光PCR扩增，通过对每个反应室进行检测、统计阳性和阴性反应的数量，根据泊松分布进行校正，最终计算出初始样品中目标核酸的精确拷贝数[36-38]。

表2 目标基因、引物及探针相关信息

国内dPCR用于食品中源性成分检验的研究大多为动物源性成分检验，王珊等[39]建立了一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法，并将该方法与行业标准SN/T 2051—2008中实时荧光PCR方法做对比，结果表明2种方法均能检出样品含有的羊源和猪源性成分，而微滴式数字PCR方法（ddPCR）能够对DNA模板定量分析。苗丽等[40]为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立的微滴数字PCR定量检测系统能够准确检测出不同样品中羊肉的含量，并发现可能存在掺假现象，建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力。王强等[41]利用ddPCR技术对食品和饲料中鹅源性成分进行检测与精确定量，所设计的引物及探针具有良好的种间特异性和种内保守性，可用于对食品和饲料中鹅源性成分进行检测和精确定量。邓珍丹[42]建立肉制品含有不同的鸡、牛、羊、猪、鸭源性成分检测的微滴数字PCR定量检测方法，能够更加快速、有效的检测出动物源性成分，特异性强，方法快速准确。史艳宇等[43]建立的鸭源性成分检测方法能够有效对鸭源性成分进行检测，特异性强，灵敏度高，并且其他物种成分的存在对方法灵敏度检测没有影响，可以实现畜肉食品中的鸭源性成分检测。

dPCR用于食品中植物源性成分检验的研究相对较少，杨硕等[44]为市售核桃乳中核桃源及主要掺杂物种大豆两种源性成分建立准确、快速定量检测方法，结果显示该方法引物探针特异性好，目标物种间无交叉反应；灵敏度高，核桃中掺杂大豆的质量检测限为0.5%，相对误差为5.6%。多重微滴式数字PCR准确、快速的定量方法可作为鉴别核桃乳中掺杂使假问题的有效手段。杨硕等建立了市售椰子汁饮料产品中目的种源成分（椰子）和非目的种源成分（大豆、花生）的分子生物学检测鉴定方法，研究显示ddPCR法对可疑结果进行验证可避免假阳性结论[45]。

3 其他检验方法

3.1 蛋白电泳

通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE），可鉴定核桃、杏仁、花生、大豆中的蛋白成分。方法采用植物活性蛋白质提取试剂盒分别提取预处理后的核桃、杏仁、花生、大豆等样品中的蛋白质成分，计算蛋白质的相对分子量，之后分别进行SDS-PAGE检测得到这几种蛋白成分的特征条带，并对不同样品中蛋白成分的电泳图谱进行比对。结果显示，每一物种都有相对应的蛋白指纹图谱，不同种类的核桃含有相同的蛋白质亚基，具有高同源性，但核桃与花生、黄豆和杏仁含有不同种类大小的蛋白，具有高特异性。吴亚君等[46]通过优化条件，建立牛乳毛细管凝胶电泳方法，检测到大豆水解蛋白标志峰，分别测定纯大豆水解蛋白溶液及牛乳-大豆水解蛋白混合溶液中的水解蛋白标志峰峰面积-浓度线性关系，并将毛细管电泳与SDS-PAGE垂直板电泳及蛋白芯片电泳进行比较，验证了毛细管电泳结果。

3.2 色谱法

吕品等[47]采用高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱对饮料中生物碱、皂苷和有机酸等24种植物源性成分进行快速筛查、定性识别和准确定量。研究表明，24种化合物在50～750 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995。样品中各化合物的检出限为 8～20 μg/L。 在 3 种添加量（70 μg/L、250 μg/L、700 μg/L)条件下，其平均回收率为63.0%～126.6%，相对标准偏差为4.11%～14.73%。该方法利用精确质量数匹配和自建标准库检索，实现快速筛查，并使用多级特征碎片离子进行确证，具有快速、高效、准确等优点。李莹莹等[48]采用基于液相色谱串联质谱技术测定肉类食品中多种植物源性成分的方法，检测肉类食品中的特征多肽，并与标准植物成分的特征多肽进行比较，从而判定对应的植物源性成分，可实现对特征性多肽的快速筛选以及对肉类多种植物源性成分的准确鉴别，且方法在目标蛋白筛选过程进行了优化，集中有效目标蛋白的数量，提高了特异性多肽的筛选速度和效率。为了检测样品中是否含有山嵛酸以及检测核桃乳中是否掺有花生乳，可通过高效液相色谱法检测样品中是否含有大豆异黄酮来鉴别核桃乳中是否掺有大豆乳。

3.3 电子鼻

电子鼻检测技术是一种分析、识别物质“风味”的新型检测手段，能够模拟人类的鼻子检测风味物质，具有分析快，结果可靠等优点。采用电子鼻对市售不同品牌及不同品种的芝麻酱进行识别，并在芝麻酱中分别添加不同比例的自制花生酱进行掺假，对电子鼻响应信号进行主成分分析、辨别因子分析、偏最小二乘回归分析和统计质量控制分析的结果表明，电子鼻能有效识别不同品牌的黑芝麻酱、白芝麻酱及混合芝麻酱；各掺假芝麻酱样品随着掺假比例的增加（0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%），样品的分布呈现出一定的规律性，电子鼻响应信号与掺假样品之间有较好的相关性，相关系数为0.99；对掺假芝麻酱建立了偏最小二乘回归模型，模型预测值误差为0.7%～2.7%。

4 讨论

在实际工作中，PCR法存在一些缺点，如结果观察依赖于琼脂糖电泳，存在环境污染和人员危害的风险；电泳条带的大小不能完全确定是否与目标条带大小一致；出现阳性结果时还需进一步进行测序进行确认等。若设计多重PCR开展多个项目的检验，不仅需要在设计引物时考虑引物与引物、引物与模板之间的影响，还要考虑反应条件的协调，在能满足以上设计需求的情况下，在结果观察时还需要考虑产物条带的大小，回收时是否有条带重叠的情况等，因此，目前尚无开发多重PCR的报道。

随着实时荧光PCR技术的发展，现在已经有多种荧光素进行标记，比如，Cy5、HEX、VIC、FAM、Cyan500、ROX、Red640 等，因此，如果设计合理，原则上可实现同一反应中同时检测多个源性成分的多重PT-PCR方法。在动物源性成分检测中，有相关学者建立了同一管中同时检测出猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光定量PCR方法，在植物源性成分检验中也有学者进行探索[50]。

dPCR目前应用并不多，但由于其自身的特点可以获得绝对定量的结果，可以应用于某些食品的含量检验中。如GB/T 19855—2015《月饼》[51]细化了莲蓉月饼的莲蓉类馅料中莲子的含量应该不低于60%、莲子含量为100%才能称为纯莲蓉；栗蓉类月饼的馅料中板栗含量不能低于60%等条件内容，目前尚无具体方法进行检验，而dPCR在这一领域具有较好的前景。

电泳法也属于分子生物学方法，对蛋白分子电泳后，通过比较分析分辨是否掺有其他植物源性成分；色谱法和电子鼻等技术属于成分分析法，通过筛选获得特定的目标成分作为标志物，以此作为其他植物源性成分的指征，这些方法都需要在前期进行大量的统计、分析、筛选工作，以确保实验结果的准确性，在实际工作中具有较强的探索意义。

随着食品安全监管对食品中植物源性成分检验技术的需求增加，现阶段RT-PCR正逐步成为主流的检验技术，且食品安全监管部门已经发布基于RTPCR的食品补充检验方法作为检验依据，但随着监管维度的扩宽和力度的加深，其他方向的检验方法也会在日后检验技术的发展之中占有一席之地。