H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作平台的建立

陈新武，石晓娜，潘 学，李雪松，杨健美，刘芹防，陈鸿军，滕巧泱，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

H9N2亚型禽流感病毒（Avain influenza virus，AIVs）是一种低致病性家禽疾病，能够造成禽呼吸道疾病，导致家禽的产蛋量下降[1-2]，而且它能够与其他病原体混合感染，导致它们与家禽的严重发病率和死亡率相关[3-4]，给家禽业造成了重大的经济损失。在我国，尽管有很多H9N2 AIV的疫苗在应用，但该疫情的暴发依然无法有效控制。

H9N2亚型禽流感病毒最早是在火鸡中被发现的，而后又在鸡、鸭等以及哺乳动物中被发现[5-6]，近年来，H9N2禽流感病毒已成为亚洲流行最广泛的禽流感病毒[7]。过去20年分离到的H9N2亚型禽流感病毒的抗原和遗传分析表明，这些病毒正在不断进化，并与其他禽流感病毒重新组合，产生多种新的基因型[8-10]。虽然H9N2亚型禽流感病毒是一种家禽疾病，但是它也能够感染人[1,12-13]。血清学调查结果表明，1.4%的人群含有H9N2禽流感病毒的抗体，养殖场工人抗H9N2病毒的阳性血清率更是高达为2.3%～37.2%，被认为是潜在的大流行威胁[7,14]。本研究建立了H9N2亚型禽流感病毒的8质粒反向遗传操作系统，为进一步探究2009年之前的H9N2亚型禽流感病毒和2009年之后的病毒在鸡群中的传播能力，以及它们之间致病性差异等分子机制搭建了技术平台。

1 材料和方法

1.1 毒株与载体 A/Chicken/Shanghai/1/2006（H9N2）（SH1）禽流感病毒由本实验室分离保存（GenBank登录号分别为PB2：KP865915.1；PB1：KP865868.1；PA：KP865812.1；NP：KP865778.1；HA：KP865927.1；NA：KP865974.1；M：KP866018.1；NS：KP866062.1）；8质粒流感病毒拯救系统双向表达转录载体PLLB为本实验室保存。

1.2 菌种、细胞和实验动物E.coliDH5α感受态细胞购自擎科生物上海公司；293T细胞由中国农业科学院上海兽医研究所流感病原生态学创新团队提供，SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3 主要试剂 RNeasy Mini Kit、HiSpeed Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit购自诺唯赞公司；StuⅠ限制性核酸内切酶购自NEB公司；Axyprep DNA Gel Extraction Kit购自AXYGEN公司；FBS胎牛血清购自Gibco公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂购自MIRUS公司。

1.4 引物 根据A型流感病毒各基因片段的保守序列设计目的片段通用扩增引物，并参照使用了流感病毒反转录通用引物12 bp（表1），所有引物均由苏州金维智生物公司合成。

1.5 提取病毒RNA和扩增目的片段 根据RNeasy Mini Kit的说明书，从140 μL的SPF鸡胚尿囊液中抽提病毒的总RNA，抽提完成后立即进行反转录实验，以反转录得到的病毒单链cDNA为模板进行RT-PCR实验，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase超保真DNA聚合酶扩增得到该株禽流感病毒的8个基因片段：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。

表1 A型流感病毒通用扩增引物Table1 The primers of H9N2 AIV in this study

1.6 真核表达载体的酶切和纯化 重组质粒构建用的真核表达载体PLLB需要用限制性核酸内切酶StuⅠ进行酶切处理，酶切完成后通过琼脂糖凝胶电泳，在紫外切胶仪内切割目的条带，然后按照Gel Extraction Kit说明纯化回收切割完全的载体。

1.7 真核表达质粒的构建 按照上述同样的纯化回收方法回收纯化RT-PCR扩增的8个基因片段产物。然后按照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit的说明书用同源重组的方法连接目的片段和载体。连接完成后，根据E.coliDH5α感受态细胞的使用说明，将连接产物转化进感受态细胞内，然后将活化好的菌液转到含有氨苄青霉素的固体LB培养基上并均匀涂板，置于37℃恒温培养箱中，12 h后在超净台内挑取平板上的单个小菌落至于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃恒温摇床内培养12～14 h后取出。将测序正确的阳性菌液，在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中扩大培养后，采用Hispeed Midi Plasmid kit提取质粒，并测定质粒的浓度。

1.8 拯救病毒 将293T细胞传代培养于直径为35 mm的细胞培养皿中，待细胞长至90%左右时进行转染。具体的操作方法如下：在超净台内取两个无菌的2.0 mL的EP管并分别加入250 μL的opti-MEM培养液，向其中一管内加入24 μL的TransIT-293转染试剂，混合均匀后，静置5 min，再另外一管内加入构建好的相应的8种质粒，每种质粒加入1 μg的量，混合均匀后，静置5 min，然后将两管溶液混合到一个EP管中，静置25 min，并在静置期间，用提前预热的opti-MEM培养液轻柔洗细胞两次，静置完成后，向EP管中补加1.5 mL的opti-MEM，混合均匀后将混合液轻柔加入35 mm的细胞培养皿中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养48 h，然后向35 mm的细胞培养皿内加入2μL的TPCK-trypsin，并于细胞培养箱内孵育2 h，用注射器重新悬浮细胞并将细胞混合液接种到9～11日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚600 μL，将接种后的鸡胚于37℃继续孵化48 h，然后进行鸡胚尿囊液的血凝价测定，收集血凝效价比较高的鸡胚尿囊液，分装并放在-80℃超低温冰箱保存，命名并记录为rSH1。

1.9 鉴定拯救病毒的基因序列 使用RNeasy Mini Kit提取所取尿囊液的总RNA，即本研究所拯救病毒的RNA，反转录获得cDNA，再使用普通DNA聚合酶PCR mix（东盛生物）以及设计的引物扩增病毒的8个基因片段。PCR反应体系：2×PCR mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，加入ddH2O补至25 μL。94℃预变性30 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸150 s，循环30次；72℃延伸10 min。使用DNAStar软件中的Seqman程序比对拯救的重组病毒rSH1和亲本病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006的序列，确定其序列是否一致。

2 结果

2.1 目的片段的PCR扩增结果 提取出病毒的总RNA，逆转录获得病毒的单链cDNA，然后通过聚合酶链反应扩增目的基因片段。结果显示，通过RT-PCR扩增出的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS目的片段的大小与目标序列是相同的，见图1。

图1 H9N2 AIV SH1株 8 个基因片段的 RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification results of eight gene segments from H9N2 AIV SH1 strain by RT-PCR

2.2 构建重组质粒及拯救病毒结果 将纯化后目的片段与PLLB载体同源重组连接后，转化至E.coliDH5α感受态细胞中。将测序正确菌液扩大培养后，提取质粒并测序，通过比对序列可知，本研究构建的8个质粒序列均和原目的片段序列一致。通过脂质体瞬时转染的方法将这8个重组质粒转染293T细胞后，成功获得拯救病毒rSH1，其血凝效价为211，见图2。

图2 AIV野毒SH1株和拯救病毒rSH1株血凝效价测定Fig.2 The hemagglutination titers detection of AIVSH1 strain and rSH1 strain

2.3 拯救病毒的序列鉴定结果 从拯救病毒的相应鸡胚尿囊液中成功提取了病毒RNA，然后用A型流感病毒通用性扩增引物（表1）进行各基因的RT-PCR扩增，扩增的8个片段大小与预期符合（图3），测序结果显示，获救重组毒株的每个基因片段的序列与亲本毒的序列完全一致，说明本研究成功拯救出了重组病毒rSH1。

图3 H9N2 AIV rSH1株 8 个基因片段的鉴定结果Fig.3 The identification of eight gene segments of rSH1

3 讨论

H9N2亚型禽流感病毒虽然是一种低致病性病毒，但该病毒在自然界中存在范围很广，传播能力也很强，给我国养禽业带来了巨大的经济损失。H9N2亚型禽流感病毒易和其亚型的流感病毒相互重组产生新的基因型，从而导致新病毒的复制能力产生明显差异[11]。另外，H9N2亚型禽流感病毒能够直接感染哺乳动物，包括人、猪、狗等，现在已经有多起人感染的案例被报道[12-13,15]。血清学调查结果也表明，近些年来，人的血清阳性率在不断的升高，虽然不会导致人死亡，但它是流感病毒发生大流行的潜在威胁，H9N2亚型流感病毒很有可能成为下次流感暴发的重要原因，给社会带来恐慌。

氨基酸位点的改变能够对流感病毒的毒力产生很大影响，有时即便是一个氨基酸位点的变化就能使毒株的致病性发生变化。氨基酸位点的改变可以导致H9N2亚型流感病毒的受体结合位点发生改变，从而使禽源病毒转化为人源病毒[16-18]。氨基酸位点的改变还会导致流感病毒的膜融合、酸稳定性、热稳定性以及传播性等病毒特性发生变化[19-22]。因此，要解析H9N2亚型禽流感病毒的致病性及其分子机制，需要在不同毒株的病毒模型上来研究，反向遗传操作系统拯救病毒就成为了必不可少的一个技术手段。

反向遗传操作系统拯救病毒是目前最有效的病毒拯救方法，并且不断将之前使用的12和17质粒拯救系统改进为8质粒拯救系统，其拯救效率得到了大大的提升。从1966年首次分离出H9N2 AIV到21世纪，对于H9N2亚型禽流感病毒在传播、重组以及在自然条件下的遗传进化等的机制研究并没有很清晰完善的结论。现有的研究主要以拯救表达H9 HA和H9 NA蛋白的PR8为背景的重组病毒或2009年以后的病毒分离株为主，尚无2009年之前的禽源分离株的反向遗传操作平台。本研究成功构建了H9N2亚型禽流感病毒毒株的8质粒反向遗传操作系统，并且从293T细胞中成功拯救出了重组病毒，通过二代测序鉴定该重组病毒的各基因片段序列，结果与野毒株的相应序列是一致的。本研究为进一步通过点突变技术深入研究H9N2亚型禽流感病毒的膜融合、酸稳定性、热稳定性、从细胞膜的释放等分子机制奠定了基础，为H9N2亚型禽流感病毒的防控和预警提供了有力的技术手段。