水相中氢气浓度检测方法的建立

张昭， 魏娅楠， 仪杨， 马胜男， 张晓康， 马雪梅， 张鑫

北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124

氢气(H2)无色无味，是自然界最小的分子，同时也是宇宙中含量最多的元素。过去H2被认为是生物惰性气体。近年来，随着对其生物学功能的深入研究，研究人员认为H2可能是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)之后又一个重要的气体信号分子[1]。2007年Ohsawa等[2]发现氢气可显著改善脑缺血再灌注损伤，由此引起了对于氢气的研究热潮。研究表明，H2对多种人类疾病和病理状态都具有明显的缓解和治疗效果，如氢分子在抗氧化、抗炎症等方面都发挥着重要作用[3-6]。此外，H2在植物学上也具有重要的生理作用，其不仅可提高植物对生物/非生物胁迫的抗性，还参与调控植物的生长发育[7-9]。

目前饮用富氢水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的摄取氢的方式[10-18]，水相中氢气浓度的准确测定是各项研究以及后续生产应用的前提和基础。目前，测定溶液中氢气浓度的方法主要有电极法、气相色谱法和氧化还原滴定法[19]。电极法是通过测定溶液中氧化还原电位的变化而确定溶液中氢气的浓度；气相色谱法主要依据样品成分与色谱柱沸点、极性或吸附性的不同，气体通过色谱柱时被分离，各种物质到达检测器时间有所不同，从而可以对待测组分进行定性和定量测定；氧化还原滴定法是利用亚甲基蓝在胶体铂催化下与氢气发生氧化还原反应使亚甲基蓝褪色，通过亚甲基蓝的用量计算出溶液中氢气的含量[19]，但此方法误差较大，且准确度不高。基于此，本研究探究分别利用氢气微电极和顶空气相色谱检测小体系溶液中氢气浓度的可行性，并对这2种方法进行比较，以期建立一种可广泛用于氢气生物学研究和相关产品研发的氢气浓度检测方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器设备

标准氮气、氧气购自北京诚为信气体有限公司。Milli-Q Advantage A10纯水设备购自美国Millipore公司；ZK-300纯水氢气发生器购自北京中科汇恒技术开发有限公司；氢气微电极购自丹麦Unisense公司；GCMS-QP2010 Ultra气质联用仪购自日本岛津公司，配备同公司的介质阻挡放电氦等离子体检测器(dielectric barrier discharge ionization detector，BID)、SH-RtTM-Msieve 5A色谱柱；气相色谱瓶购自美国安捷伦科技有限公司。

1.2 饱和HRW的制备

将纯水氢气发生器制得的氢气(99.999%)通入100 mL超纯水(ddH2O)中以制备HRW，每隔10 min使用氢气微电极测定一次，直至饱和，氢气在20 ℃下溶解度为1.62 mg·L-1[20]。制得饱和HRW后，立即使用ddH2O稀释，配制成不同浓度的HRW(表1)以用于测定标准曲线，溶液总体系为500.0 μL。

表1 高浓度和低浓度HRW配制Table 1 Preparation of high concentration and low concentration HRW

1.3 电极法测定HRW中氢气浓度

1.3.1电极极化 将氢气微电极浸泡于ddH2O中，电极极化电压设置为1 000 mV，随后逐渐下降，并最终稳定在某一数值，待此数值稳定10 min以上后，电极极化结束，可以开始样品检测。电极极化时间一般需要1～2 h。

1.3.2样品检测 将500 μL不同浓度的HRW置于1.5 mL离心管中，将电极插入液面以下，待信号值稳定后，记录数据。

1.4 气相色谱法测定HRW中氢气浓度

1.4.1气相色谱参数设定 采用恒线速度控制方法，恒线速度60 cm·s-1，使用SH-RtTM-Msieve 5A色谱柱，柱温50 ℃，进样口温度为250 ℃，分流比为5∶1，压力为200.2 kPa，柱流量为3.85 mL·min-1，检测器为BID。

1.4.2可行性鉴定 为了鉴定利用气相色谱法测定水相中氢气浓度的可行性，利用99.999%的标准氢气、氮气、氧气在1.9 mL气相色谱瓶中配制混合气体。按照1.4.1进行参数设定，对混合气体样品进行分离测定。

1.4.3平衡时间对于气相色谱法测定结果的影响 平衡时间是指在一定条件下达到Henry平衡所需要的时间。由Henry平衡定律可知，在密闭空间中，当密闭空间中气液体积比大于2时可近似认为液相中的气体全部转化到气相中[21]。因而，按照1.4.1进行参数设定，测定在37 ℃、500 r·min-1的条件下[20]达到Henry平衡所需要的时间。

1.4.4样品检测 将不同浓度的HRW置于1.9 mL气相色谱瓶中，溶液总体系为500 μL。达到Henry平衡后[20-21]，采用顶空法手动进样1 mL。

1.5 方法检出限及精确度分析

1.5.1电极检出限的确定 取少量HRW，使1.5 mL离心管中HRW的浓度为预期方法检出限(method detection limit，MDL)的1～5倍，按照1.3进行测定。根据刘丽君等[11]的MDL测定方法，MDL的计算公式如下：

MDL=S×t(n-1,1-a=0. 99)

式中：n—重复测定样品数；S—n次测定浓度的标准偏差；t—自由度为n-1时的 Student值；1-a—置信水平。

1.5.2气相检出限的确定 取少量HRW，使HRW的氢气浓度为预期MDL的1～5倍，达到Henry平衡后，按照1.4进行测定。计算方法同1.5.1。

1.5.3精确度计算 对于某一浓度样品(在高、低浓度范围内随机配制)平行测定9次，计算标准偏差及变异系数。

2 结果与分析

2.1 饱和HRW的制备

向100 mL ddH2O中通入氢气(99.999%)，水相中氢气的浓度随着通氢气时间的延长而增加，如图1所示，在常温常压条件下，通氢气20 min即可制得饱和HRW。

图1 饱和HRW的制备Fig.1 Preparation of saturated HRW

2.2 电极法测定水相中氢气浓度

2.2.1标准曲线 利用氢气微电极分别测定高浓度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低浓度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氢气的浓度。以水相中氢气浓度为纵坐标，以氢电极的信号值为横坐标，绘制标准曲线。如图2A所示，高浓度HRW标准曲线方程为y=0.001 402x-0.028 35，相关系数(R2)为0.999 8；如图2B所示，低浓度HRW标准曲线方程为y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低浓度、高浓度HRW中，水相中氢气浓度与氢气微电极信号值之间均具有良好的线性关系。

图2 氢电极法检测水相中氢气浓度标准曲线Fig.2 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by hydrogen microsensor

2.2.2精确度分析及检出限分析 利用氢气微电极对某一高浓度(0.72 mg·L-1)、低浓度(0.012 mg·L-1)样品进行9次平行测定，对该测定方法进行精确度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范围内，该方法的标准偏差为0.012 9 mg·L-1，变异系数为1.775 3%。结果表明该方法精确度较高，满足水相中高浓度氢气的测定要求。

表2 电极法检测高浓度和低浓度HRW的精确度分析Table 2 Accuracy analysis of high concentration and low concentration HRW detection by hydrogen microsensor

由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范围内，用电极法测定低浓度HRW的样品的标准偏差为0.001 3 mg·L-1，变异系数为11.734 0%。根据1.5中的公式，t(8,1-a=0. 99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明该方法精确度较高，满足水相中低浓度氢气的测定要求。

2.3 气相色谱法测定水相中氢气浓度

2.3.1方法可行性鉴定 采用顶空气相色谱法对混合样品进行分离测定。如图3所示，按照1.4.1设定仪器工作条件，氢气、氧气和氮气可以完全分离，氢气、氧气和氮气的保留时间分别为(1.0±0.1)min、(1.4±0.1)min、(2.1±0.1)min。3.0 min之内即可完成样品的测定，是一种可以快速有效的分离测定氢气浓度的方法。

图3 气相色谱检测图Fig.3 Mass spectrum of hydrogen gas analyzed by gas chromatogram

2.3.2平衡时间对于产氢的影响 为了确定HRW中氢气完全从超纯水中逸散的平衡条件，测定不同平衡时间下顶空中的氢气浓度。如图4所示，在37 ℃、500 r·min-1条件下平衡10 min即可达到Henry平衡。

图4 不同平衡时间对气相检测氢气浓度的影响Fig.4 The effect of equilibrium time on the detection of HRW by gas chromatogram

2.3.3标准曲线 利用气相色谱分别测定高浓度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低浓度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氢气的浓度。以HRW中氢气的浓度为纵坐标，以气相色谱峰面积为横坐标，绘制标准曲线。如图5 A所示，高浓度HRW标准曲线性方程为y=1.642×10-6x-0.047 78，R2=0.996 2。如图5B所示，低浓度HRW标准曲线方程为y=1.961×10-6x-0.005 294，R2=0.999 7。因此，结果表明，低浓度、高浓度HRW中氢气浓度与气相色谱峰面积之间具有良好的线性关系。

2.3.4精确度分析 按照1.4.1设定仪器工作条件，对某一高浓度(0.72 mg·L-1)、低浓度(0.002 5 mg·L-1)样品进行9次平行测定，对测定结果进行精确度分析。由表3可知，在0～1.620 0 mg·L-1范围内，该方法测定的标准偏差为0.052 0 mg·L-1，变异系数为7.694 5%。结果表明该方法精确度较高，满足水相中高浓度氢气的测定要求。

由表3可知，在0～0.202 5 mg·L-1浓度范围内，该方法测定的标准偏差为0.000 3 mg·L-1，变异系数为9.926 7%。根据1.5中的公式，标准偏差S=0.000 3 mg·L-1，t(8,1-a=0. 99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0. 99)=0.000 9 mg·L-1。表明该方法精确度较高，满足水相中低浓度氢气的测定要求。

图5 气相色谱法检测HRW中氢气浓度的标准曲线Fig.5 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by gas chromatogram

表3 气相色谱检测高浓度和低浓度HRW精密度分析Table 3 Accuracy analysis of high concentration and low concentrantion HRW detection by gas chromatogram

3 讨论

本研究建立了使用氢气微电极以及气相色谱测定水相中氢气浓度的方法。2种方法对于高浓度和低浓度HRW中氢气的检测均具有良好的线性关系。电极法测定高浓度、低浓度的HRW的变异系数分别为1.775 3%、11.734 0%，气相色谱法测定高浓度、低浓度的HRW的变异系数分别为7.694 5%、9.926 7%，电极法及气相色谱法的样品方差均在12%以内，因此2种方法均可以精确测定溶液中氢气的浓度。

气相色谱法对水相中氢气浓度的MDL为0.000 9 mg·L-1，高于电极法的0.004 4 mg·L-1，表明气相色谱法更适用于对水相中低氢气浓度的测定。但是从检测方式来看，电极法可以直接实时监测水相中氢气的浓度；气相色谱法只能通过测定顶空氢气进而间接得到溶液中的氢气浓度，无法实时监测。从测定原理来看，电极法根据溶液中氧化还原电位的变化而测定溶液中氢气的含量，由于生物样本成分较为复杂，电极法的测定结果容易受到多种因素的干扰；而气相色谱法是先将氢气与其他物质在色谱柱上进行分离，再通过灵敏度高、重复性好的BID进行分析，能够实现快速完成永久性气体的检测。综上所述，对于需要实时监测的样品，使用氢微电极法较为合适；对于成分复杂或者氢气浓度较低的样品，则可优先选择气相色谱法。