一株棘胸蛙源蛙病毒的分离与鉴定

程晓云 傅秋华 王卫东

摘要 通过对棘胸蛙（Quasipaa spinosa）患病个体结合人工感染试验、PCR检测和系统发育分析对分离病原进行鉴定。结果表明，将患病的棘胸蛙肝、脾、肾等组织研磨匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞（EPC），出现明显细胞病变。人工注射感染棘胸蛙表现出与自然患病相似的症状，14 d累计死亡率达到80%。通过对蛙病毒MCP基因的PCR检测及系统发育树分析发现，分离的棘胸蛙病毒与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上，且与蛙病毒属FV3病毒类群聚为同一分支，暂命名为棘胸蛙蛙病毒（Quasipaa spinosa ranavirus，QSRV）。

关键词 棘胸蛙;蛙病毒属;鉴定

中图分类号 S947.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）05-0100-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract The isolated pathogens were identified by combining with artificial infection test， PCR detection and phylogenetic analysis on the diseased individuals of Quassipaa spinosa. The results showed that the liver， spleen， kidney， and other tissues of the diseased Q.spinosa were inoculated into the squid epithelial cells （EPC）， and the cytopathic effect （CPE） appeared. The artificially injected infection of Q. spinosa showed similar symptoms with those of the natural disease， with a mortality rate of 80% on the 14th day. After PCR detection and phylogenetic analysis of the MCP gene of Ranavirus， the similarity between the isolated Quassipaa spinosa virus and the ranavirus was found to be more than 99%， and it was clustered with the  FV3 virus group of Ranavirus. It was tentatively named as Quassipaa spinosa ranavirus （QSRV）.

Key words Quasipaa spinosa;Ranavirus;Identification

近年来，虹彩病毒可导致蛙类、龟鳖等两栖爬行类以及众多海、淡水鱼类染病，并引发大量死亡，因而愈来愈受到关注。根据国际病毒分类委员会（CTV）第9次报告，虹彩病毒科被分为5个属：虹彩病毒属（Iridovirus）、绿虹彩病毒属（Chloriridovirus）、蛙病毒属（Ranavirus）、淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）和肿大细胞虹彩病毒属（Megalocytivirus）[1]。其中，蛙病毒属（Ranavirus）是一类感染两栖类、爬行类及鱼类等动物的双链DNA病毒。张奇亚等[2]于1996年从患有溃疡性致死综合症的沼泽绿牛蛙（Rana grylio）分离到蛙病毒，并将其命名为沼泽绿牛蛙病毒（Rana grylio virus，RGV）。蛙病毒具有极强的传播能力，近年来随着两栖爬行类品种养殖规模的逐渐扩大，蛙病毒感染造成的危害也愈加严重[3-5]。Green等[6]分析了1996—2001年美国两栖类死亡事件，其中57%的两栖类死亡事件与蛙病毒有关。

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）是我国重点保护野生动物之一，也是我国养殖的特色经济蛙类，因其肉质细腻、鲜美、营养丰富，兼具食用和药用功能，具有显著的经济、社会和生态效益[7]。近年来，棘胸蛙养殖中的病害种类也逐渐增多，已陆续报道了歪头病、白内障、烂皮病等病害[8-11]。2016年浙江等地的棘胸蛙养殖场陆续发现未知病原引起的病害，主要表现四肢肿胀或溃烂，腹部有发红充血点。死亡率高，给养殖户造成较大的经济损失。为明确其病因，笔者对浙江某棘胸蛙养殖场患病蛙進行了病原分离，通过回归感染验证其病原性，并对该病原进行分子生物学鉴定，旨在为该病的诊断与防控提供依据与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

发病棘胸蛙于2016年6月采自浙江省遂昌县某养殖场，共采集病蛙3只（2雄、1雌），平均体质量为（45.5±7.8）g，用于病原分离;健康棘胸蛙幼蛙购自金华某养殖场，共25只，平均体质量为（23.0±1.5）g，用于人工感染试验。胎牛血清（FBS）、M199培养基、0.25%的胰酶溶液（含EDTA）均购自 Hyclone公司;Vira DNA/RNA Kit试剂盒购自康为世纪。

1.2 临床症状观察及细菌学检查

观察送检棘胸蛙体表及内脏情况，无菌操作取肝脏、脾、肾脏划线接种于琼脂平板，在30 ℃条件下培养24～48 h，观察细菌生长情况。

1.3 病毒培养

将患病的棘胸蛙内脏组织匀浆液按1∶5（V/V）加入混有双抗（青链霉素活性为1 000 U/mL）的无菌水冰上研磨匀浆，4 ℃条件下12 000 r/min离心6 min，0.22 μm滤膜过滤后接种于单层的鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）培养液中，25 ℃培养，盲传3代，逐日观察细胞病变。在EPC细胞70%～80%出现病变时收获细胞培养物，-80 ℃和室温条件下冻融2次，于4 ℃条件下4 000 r/min离心20 min，收集上清液，备用。采用Reed-Muech法[12]计算病毒半数感染量（TCID50）。