扁桃斑鸠菊抗乳腺癌活性部位筛选研究

姚苏芝，赵亮 ，钟永红，罗秋莲，莫静 ，王怡媛，林翠梧，王立升，罗轩*

(1.广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004；2.第二军医大学 东方肝胆外科医院，上海 200438)

0 引言

扁桃斑鸠菊(Vernoniaamygdalina)，因其本身带有苦味又被称为“苦叶”[1-2]，是菊科(Compositae)植物中的一种，为多年生灌木，高度可达10 m以上，树干直径约40 cm[3]。扁桃斑鸠菊不仅广泛分布在非洲地区，亚洲地区也有发现，在新加坡和马来西亚尤其常见，在喀麦隆、加纳和尼日利亚等许多西非国家，扁桃斑鸠菊的茎和根被当作咀嚼棒，而叶子则成为当地一种可食用的叶类蔬菜，是一种药食两用植物[4-6]。因其具有重要的药用价值以及经济发展潜力，我国南方部分地区有专业种植户进行种植[7]。至今，有多种活性物质从扁桃斑鸠菊中分离得到，如具有抗氧化性的黄酮类[8],具有细胞毒性的倍半萜内酯[9-10],具有抗炎作用的甾体皂苷等[11]。

研究表明，扁桃斑鸠菊叶子的提取物具有多种生物活性，其水提取物具有抗氧化活性[12]，丙酮提取物具有驱虫作用[13]，醇提取物具有抗菌活性[14]。另外，有文献报道，扁桃斑鸠菊叶子乙醇提取物和氯仿提取物对MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有一定的抑制效果[6,15]。在我国以及全世界范围内，乳腺癌仍然是导致死亡的主要原因之一，因此，对扁桃斑鸠菊提取物的抗乳腺癌有效成分进行研究具有重要意义。到目前为止，对扁桃斑鸠菊中确切的抗乳腺癌活性成分的研究还未见报道。因此，本文通过CCK-8法细胞毒实验来评价扁桃斑鸠菊叶子不同极性部位提取物对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果，并筛选出抗乳腺癌活性最佳的活性部位，为以后进一步探讨扁桃斑鸠菊抗乳腺癌活性成分提供方向。

1 实验

1.1 材料与试剂

材料：扁桃斑鸠菊叶子采摘于广东省广州市；人乳腺癌细胞(MCF-7)，生产厂家为南京科佰生物科技有限公司；硅胶板和硅胶，生产厂家为青岛海洋化工股份有限公司。

试剂：石油醚(60～90 ℃)、无水乙醇、乙酸乙酯等，以上实验试剂均为分析纯，生产厂家为西陇化工股份有限公司；培养基和PBS，生产厂家为美国Gibco公司，CCK-8，生产厂家为日本同仁化学研究所。

1.2 仪器

RE-5299型旋转蒸发仪，生产厂家为巩义市予华仪器有限公司；MK3型酶标仪和3111型二氧化碳培养箱，生产厂家为美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 扁桃斑鸠菊不同提取方法

将晒干的扁桃斑鸠菊叶子处理为粉末状，选择极性不同的溶剂和不同提取温度，设计了三种提取路线，最终得到各部位提取物。

路线一：200 g扁桃斑鸠菊粉末，先用600 mL石油醚在室温下提取120 min，重复3次，提取后抽滤，滤渣放置于通风橱中挥去溶剂，滤液经减压蒸馏获得石油醚提取物(VA1)；滤渣用600 mL乙酸乙酯在室温下提取120 min，重复3次，提取后抽滤，滤渣放置于通风橱中挥去溶剂，滤液经减压蒸馏获得乙酸乙酯提取物(VA2)；最后用85 %乙醇在室温下提取滤渣120 min，重复3次，提取后抽滤，弃去滤渣，滤液经减压蒸馏获得乙醇提取物(VA3)。

路线二：200 g扁桃斑鸠菊粉末，先用600 mL石油醚在50 ℃下提取120 min，重复3次，提取后抽滤，滤渣放置于通风橱中挥去溶剂，滤液经减压蒸馏获得石油醚提取物(VA4)；滤渣用600 mL乙酸乙酯在50 ℃下提取120 min，重复3次，提取后抽滤，滤渣放置于通风橱中挥去溶剂，滤液经减压蒸馏获得乙酸乙酯提取物(VA5)；最后用85 %乙醇在65 ℃下提取滤渣120 min，重复3次，提取后抽滤，弃去滤渣，滤液经减压蒸馏获得乙醇提取物(VA6)。

路线三：200 g扁桃斑鸠菊粉末，用600 mL的85 %乙醇提取，提取120 min，重复3次，提取后抽滤，弃去滤渣，合并滤液，滤液经减压蒸馏至提取物无醇味，得到乙醇部位提取物(VA7)。VA7用水分散为悬浊液，加入石油醚进行萃取，萃取至萃取液减压浓缩后基本无固状物；悬浊液再加入乙酸乙酯进行多次萃取，减压蒸馏萃取液获得醇提乙酸乙酯提取物(VA8)。

三种提取路线得到的各个部位的提取物，各取适量用于MCF-7乳腺癌细胞进行CCK-8细胞毒性实验。

1.3.2 乙酸乙酯部位提取物粗分

根据预实验结果，50 ℃下提取的乙酸乙酯部位提取物具有最好的抗乳腺癌活性，确立了路线二为最佳提取方法，将20 Kg晒干的扁桃斑鸠菊叶子粉碎，按照路线二进行提取，得到约450 g乙酸乙酯提取物(A1)。分别用不同的溶剂体积对A1进行薄层层析分析，结果显示乙酸乙酯-石油醚溶剂体系具有较好的分离效果，使用该体系对A1洗脱分离。A1溶解后，加入600 g柱层析硅胶搅拌均匀，吸附完全后减压蒸馏除去溶剂得到拌样硅胶，拌样硅胶依次用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚、20 %乙酸乙酯-石油醚、50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯洗脱，洗脱液减压浓缩后对应获得6个洗脱产物A2、A3、A4、A5、A6和A7。对此6个洗脱产物以及A1进行体外抗乳腺癌活性实验。

1.3.3 CCK-8细胞毒性实验

对MCF-7细胞进行传代培育，培育2～3代后，将对数生长期的MCF-7细胞调制为悬液(5 ×104个·mL-1)，在96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液(5 000个细胞·孔)，边缘孔用PBS 100 μL填充，同时设置不加待测试液的阴性对照孔(吸光值记为OD1)以及不加细胞的空白对照孔(吸光值记为OD0)，将培养板放在5 % CO2、37 ℃恒温箱中孵育24 h，取出加入试液，每孔加入100 μL不同浓度(10、20、50和100 μg/mL)的试液(吸光值记为OD)，每个浓度设置6个复孔，将培养板放在5 % CO2，37 ℃恒温箱中培养48 h。取出培养板，将培养基吸出，每孔加入PBS100 μL清洗后弃去，然后每孔加入100 μL培养基，再加入10 μL CCK-8溶液，放在5 % CO2，37 ℃培养箱中2 h后取出，培养板微微震荡后置于酶联免疫检测仪上，测量其在450 nm处的吸光值。试液的抑制率公式为

抑制率( %) = 1-(OD-OD0)/( OD1-OD0) ×100 %。

(1)

1.4 统计分析

2 结果与讨论

2.1 扁桃斑鸠菊各个部位提取物体外抗乳腺癌活性

扁桃斑鸠菊各提取物加入CCK-8试剂后培养2 h测定其体外抗乳腺癌活性，活性结果见表1。由表1可知，各部位提取物对MCF-7细胞增殖的抑制效果基本随着浓度升高而加强，呈剂量依赖性。VA2、VA5、VA7和VA8在浓度为50 μg/mL时，对MCF-7细胞的抑制率均达到了80 %以上，体外抗乳腺活性较好。VA3、VA5和VA7在浓度为50 μg/mL时，体外抗乳腺癌活性差异较为明显。其中VA7对乳腺癌细胞MCF-7的增殖表现出良好的抑制效果，其抑制率为82.68 %，VA3和VA6对MCF-7细胞的抑制率则均低于25 %，基本不具有抗乳腺癌活性，以上表明了扁桃斑鸠菊中的抗乳腺癌活性部位为乙酸乙酯部位。

表1 扁桃斑鸠菊各个部位提取物体外抗乳腺癌活性Tab.1 In vitro anti-breast cancer activity of extracts from Vernonia amygdalina

2.2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物体外抗乳腺癌活性

乙酸乙酯提取物A1及其洗脱产物A2-A7加入CCK-8试剂后培养2 h测定其体外抗乳腺癌活性，活性结果见表2。由表2可知，A1-A7对MCF-7细胞增殖的抑制作用基本随着浓度升高而加强，呈剂量依赖性。使用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚和20 %乙酸乙酯-石油醚3种低极性洗脱剂得到的组分A2、A3和A4对MCF-7乳腺癌细胞增殖的抑制效果一般；浓度为100 μg/mL时，使用50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯3种中强极性溶剂得到的洗脱产物A5、A6和A7，对MCF-7乳腺癌细胞的增殖均具有较好抑制作用，且抑制效果均优于A1，特别是A5在浓度为100 μg/mL时，抑制率达到了80 %以上，由此可知，A5、A6和A7三个洗脱产物为乙酸乙酯提取物中的抗乳腺癌活性段，可做进一步分离纯化。

表2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物体外抗乳腺癌活性Tab.2 In vitro anti-breast cancer activity of ethyl acetate extracts and its subfractions

3 结语

本研究结果显示扁桃斑鸠菊的中等极性部位，即乙酸乙酯部位，对 MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有较为明显的抑制作用。而对该部位进行粗分后的活性追踪表明A5、A6和A7这三个洗脱产物具有较好的抗乳腺癌活性，其中活性最强的组分为A5。对此三个活性段，特别是A5，可做进一步的分离纯化，明确扁桃斑鸠菊中抗乳腺癌的有效成分。扁桃斑鸠菊中等极性溶剂的提取物主要含有倍半萜内酯等物质，且倍半萜内酯具有一定的细胞毒活性。本文推测，扁桃斑鸠菊提取物中抗乳腺癌活性成分可能是倍半萜内酯类成分。本研究为后期研究扁桃斑鸠菊中单个或者一系列具有抗乳腺癌活性的单体化合物奠定了基础。