近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶双水相萃取工艺研究

王 伟,刘 云,余华顺,戴秋红,姚 鹃,龚大春*

(1.三峡大学 湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制剂事业部，湖北 宜昌443002)

利用生物催化剂羰基还原酶合成各种手性羟基药物中间体具有巨大的工业应用价值。如，羰基还原酶可以高效合成淋巴瘤新药依鲁替尼(Imbruvica)的药物活性成分的关键手性中间体(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶[(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine，(S)-NBHP][1]；合成羟甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂他汀类药物，如阿托伐他汀(Atorvastatin)的手性药物对映纯中间体的前体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE][2]；合成新型选择性胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝(Ezetimibe)的重要手性中间体的手性侧链[3]等。这些具有工业应用前景的合成路线若能找到在工业生产中大量应用的生物催化剂，可以使生产过程更加绿色环保。

近平滑假丝酵母ATCC 7330在整细胞催化应用上性能特别优异。Chadha课题组[4-8]对近平滑假丝酵母ATCC 7330的整细胞催化应用进行了详细报道，并对其在手性化合物不对称合成方面的应用给予了高度肯定；龚大春教授团队[9]也对近平滑假丝酵母ATCC 7330进行了相关报道。但关于近平滑假丝酵母ATCC 7330中游离羰基还原酶的分离工艺一直未取得突破，限制了其应用。

目前，国内对近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶的双水相萃取鲜有报道。鉴于此，作者对聚乙二醇(PEG)和硫酸铵组成的双水相体系萃取近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶的工艺进行研究，以期为近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶更好地应用于不对称氧化还原反应合成各种手性化合物奠定基础。

1 实验

1.1 菌株、试剂与仪器

近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ATCC 7330，实验室保藏。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、麦芽浸粉、蔗糖，北京奥博星生物技术有限责任公司；(NH4)2SO4、磷酸、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000，国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

VS-1300L-U型超净工作台，苏净安泰；UV1800型紫外分光光度计，日本岛津；ZQLY-180型振荡培养箱，上海知楚仪器；4L发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；离心机。

1.2 培养基

斜面保藏培养基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，琼脂20。

种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

发酵培养基(g·L-1)：蔗糖10，酵母浸粉3，蛋白胨5，麦芽浸粉3。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的制备

将近平滑假丝酵母ATCC 7330接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角摇瓶中， 28 ℃、200 r·min-1振荡培养14 h；然后接种于4 L发酵罐中扩大培养，20 h时下罐；5 000 r·min-1离心10 min，收集菌体，并用蒸馏水洗涤2次，于-80 ℃下冷冻保藏。

1.3.2 粗酶液的制备

采用超声波破碎法对酵母菌进行破壁处理。按菌体∶缓冲液=1∶5的比例加入缓冲液，混合均匀；冰水浴中超声破碎40 min(超声2 s，停4 s)；4 ℃、11 000 r·min-1冷冻离心20 min，取上清液，即为羰基还原酶粗酶液。

1.3.3 双水相体系的建立[10-11]

根据需求，按一定质量比加入无机盐及PEG，混匀，确保双水相体系达到稳定。

1.3.4 最佳萃取工艺的确定

分别考察无机盐种类、PEG分子量及质量分数、(NH4)2SO4质量分数、萃取温度及萃取时间等对羰基还原酶萃取效果的影响，确定最佳萃取工艺。以羰基还原酶的纯化倍数来表征萃取效果。

1.3.5 羰基还原酶的酶活测定及纯化倍数的计算[12]

因为辅酶NADH在340 nm处有特征吸收峰而NAD+没有，当辅酶NADH被氧化为NAD+后吸光度会下降，因此，可以通过测定反应过程中340 nm处吸光度的变化来衡量羰基还原酶的酶活。测定酶活的标准条件：总反应体积为1 000 μL，分别加入100 μL 0.2 mmol·L-1NADH、100 μL 4 mmol·L-1底物苯乙酮、700 μL 100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.5)，30 ℃恒温水浴2 min，加入适量酶液后用分光光度计测定340 nm处吸光度，按式(1)计算酶活(U·mL-1)：

(1)

式中：ΔA为1 min内340 nm处吸光度的变化；V总为反应液的体积，mL；6 220为NADH的摩尔消光系数，L·mol-1·cm-1；1为光程距离，cm；V为粗酶液的体积，mL。

酶活定义：在上述条件下，1 min消耗1 μmol NADH所需的酶量为1个酶活单位。

按式(2)计算羰基还原酶的纯化倍数：

(2)

式中：E1为萃取后羰基还原酶酶活，U·mL-1；P1为萃取后羰基还原酶蛋白含量，mg·mL-1；E2为羰基还原酶粗酶酶活，U·mL-1；P2为羰基还原酶粗酶蛋白含量，mg·mL-1。

蛋白含量的测定：采用Bradford法。

2 结果与讨论

2.1 无机盐种类对羰基还原酶萃取效果的影响

双水相体系中的无机盐种类是双水相能否形成的关键因素之一，也是所形成的双水相是否适合酶的重要因素。通常，酶在PEG中是十分稳定的。因此，将PEG1000分别与硫酸铵盐[(NH4)2SO4]体系、磷酸钠盐体系组成双水相体系，考察无机盐种类对羰基还原酶纯化倍数的影响，结果见表1。

表1无机盐种类对羰基还原酶纯化倍数的影响

Tab.1 Effect of types of inorganic salts on purificationmultiples of carbonyl reductase

无机盐种类上相酶活U·mL-1上相蛋白含量mg·mL-1纯化倍数硫酸铵盐体系0.460.652.30磷酸钠盐体系0.180.511.13

由表1可知，硫酸铵盐体系的纯化倍数高于磷酸钠盐体系，说明硫酸铵盐体系对蛋白的选择性更高。由于磷酸钠盐质量分数的变化可能会影响酶活，而蛋白在硫酸铵盐溶液中无论析出与否都十分稳定[13]；此外，硫酸铵还具有溶解速度快、分相能力强、价格便宜等优点。因此，综合考虑，选用PEG/(NH4)2SO4双水相体系。由于酶活力主要集中在上相，可见羰基还原酶主要分配在上相中，因此，双水相萃取羰基还原酶时，主要对上相进行检测。

2.2 PEG分子量对羰基还原酶萃取效果的影响

将质量分数为15%的(NH4)2SO4溶液分别与质量分数为15%的PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000配制成双水相体系，待双水相体系稳定后加入粗酶液，混匀，静置10 min，离心，取上相检测酶活与蛋白含量，计算纯化倍数，结果见图1。

图1 PEG分子量对纯化倍数的影响Fig.1 Effect of PEG molecular weight on purification multiple

由图1可知，随着PEG分子量的增大，纯化倍数先增大后减小，在PEG分子量为1 000时达到最大。因此，选择PEG1000作为成相组分。

2.3 PEG1000质量分数对羰基还原酶萃取效果的影响

将质量分数为15%的(NH4)2SO4溶液分别与质量分数为12%、15%、18%、21%、24%、27%的PEG1000溶液配制成双水相体系，待双水相体系稳定后加入粗酶液，混匀，静置10 min，离心，取上相检测酶活与蛋白含量，计算纯化倍数，结果见图2。

图2 PEG1000质量分数对纯化倍数的影响Fig.2 Effect of PEG1000 mass fraction on purification multiple

由图2可知，在PEG1000质量分数为12%～18%时，纯化倍数随PEG1000质量分数的增加而增大，当PEG1000质量分数为18%时，纯化倍数达到最大；之后，纯化倍数迅速减小。因此，选择PEG1000质量分数为15%～21%。

2.4 (NH4)2SO4质量分数对羰基还原酶萃取效果的影响

将质量分数为15%的PEG1000溶液分别与质量分数为14%、16%、18%、20%、22%、24%的(NH4)2SO4溶液配制成双水相体系，待双水相体系稳定后加入粗酶液，混匀，静置10 min，离心，取上相检测酶活与蛋白含量，计算纯化倍数，结果见图3。

图3 (NH4)2SO4质量分数对纯化倍数的影响Fig.3 Effect of (NH4)2SO4 mass fraction on purification multiple

由图3可知，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，纯化倍数先增大后减小，在(NH4)2SO4质量分数为16%时达到最大，且这个过程与(NH4)2SO4沉淀蛋白的规律相似。可以推测，在到达最适(NH4)2SO4质量分数前，(NH4)2SO4先沉淀了一些杂蛋白，从而使纯化倍数增大;但当(NH4)2SO4质量分数过高时，会使目的蛋白也沉淀下来，导致最后纯化倍数变小。实验过程中有一些白色的蛋白沉淀夹在两相中也佐证了这一点。因此，选择(NH4)2SO4质量分数为14%～18%。

2.5 萃取温度对羰基还原酶萃取效果的影响

将质量分数均为15%的(NH4)2SO4溶液、PEG1000溶液配制成双水相体系，待双水相体系稳定后加入粗酶液，混匀，分别在4 ℃、12 ℃、20 ℃、28 ℃、36 ℃、44 ℃下静置10 min，离心，取上相检测酶活与蛋白含量，计算纯化倍数，结果见图4。

图4 萃取温度对纯化倍数的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on purification multiple

由图4可知，随着萃取温度的升高，纯化倍数先增大后减小，在4～20 ℃范围内萃取温度对纯化倍数的影响较小。可见，在一定范围内，萃取温度升高可以促进双水相萃取酶的进程；但是过高的萃取温度会影响酶活性，导致酶失活，使纯化倍数减小。因此，选择萃取温度为4～20 ℃。

2.6 萃取时间对羰基还原酶萃取效果的影响

将质量分数均为15%的(NH4)2SO4溶液、PEG1000溶液配制成双水相体系，待双水相体系稳定后加入粗酶液，混匀，分别静置10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，离心，取上相检测酶活与蛋白含量，计算纯化倍数，结果见图5。

图5 萃取时间对纯化倍数的影响Fig.5 Effect of extraction time on purification multiples

由图5可知，在20 min内纯化倍数差异较小；虽然延长萃取时间有利于酶在双水相中的分配，但纯化倍数迅速减小并稳定在一定范围内。因此，萃取时间控制在20 min内为宜。

2.7 萃取工艺条件的优化

根据单因素实验结果，选取(NH4)2SO4质量分数(A)、PEG1000质量分数(B)、萃取温度(C)、萃取时间(D)为考察因素，进行4因素3水平的L9(34)正交实验优化萃取工艺。正交实验的结果与分析见表2。

由表2可知，各因素对萃取效果的影响大小依次为:(NH4)2SO4质量分数>PEG1000质量分数>萃取温度>萃取时间。进行方差分析F检验，C、D两个因素的F值分别为3.174和1.000，小于F临界值19，表明C、D两个因素对纯化倍数的影响不显著；而A、B两个因素的F值分别为22.391和22.370，远大于F临界值19，表明A、B两个因素对纯化倍数的影响显著。通过正交实验k值分析，确定最优组合为A1B3C3D1，即(NH4)2SO4质量分数15%、PEG1000质量分数19%、萃取温度16 ℃、萃取时间15 min。对此条件进行验证实验，羰基还原酶的纯化倍数达到6倍，与7号实验接近，可见在较窄时间范围内萃取时间对纯化倍数影响很小。

表2正交实验的结果与分析

Tab.2Results and analysis of orthogonal experiments

实验号A.(NH4)2SO4质量分数/%B.PEG1000质量分数/%C.萃取温度℃D.萃取时间min纯化倍数11(15)1(17)1(8)1(15)5.05122(16)1(17)2(12)2(20)4.51933(17)1(17)3(16)3(25)4.54241(15)2(18)2(12)3(25)5.79152(16)2(18)3(16)1(15)5.37263(17)2(18)1(8)2(20)4.64571(15)3(19)3(16)2(20)6.00682(16)3(19)1(8)3(25)5.29293(17)3(19)2(12)1(15)5.234k15.6164.7044.9965.219k25.0615.2705.1815.057k34.8075.5115.3075.208R0.8090.8070.3110.162F22.39122.3703.1741.000

3 结论

通过单因素实验和正交实验研究了聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系萃取近平滑假丝酵母ATCC 7330粗酶液中羰基还原酶的工艺，考察了无机盐种类、PEG分子量及其质量分数、(NH4)2SO4质量分数、萃取温度、萃取时间等因素对羰基还原酶纯化倍数的影响。结果表明，(NH4)2SO4质量分数、PEG1000质量分数为显著性影响因素，确定最优的双水相萃取条件为：(NH4)2SO4质量分数15%、PEG1000质量分数19%、萃取温度16 ℃、萃取时间15 min，在此条件下，羰基还原酶的纯化倍数可达6倍。本研究为近平滑假丝酵母ATCC 7330中羰基还原酶在手性化合物的绿色合成中的应用奠定基础。