原发性肝细胞癌血清中miR-888-5p的表达及临床意义

裴苗苗, 卢 敏, 毛 华

裴苗苗, 卢敏, 毛华, 南方医科大学珠江医院消化内科 广东省广州市510282

核心提要： 血清miR-888-5p在HCC患者血清中高表达,有助于HCC及AFP阴性HCC患者进行早期诊断, 其表达水平与HCC肺转移相关, 可提示预后.miR-888-5p具有成为HCC早期诊断、临床决策指导以及评估预后的一种血清学分子指标的潜力.

0 引言

肝癌是全球极为好发的高致死性消化系统异质性肿瘤, 2017年国家癌症中心[1]发布数据表明, 我国HCC的发病率高达28.17/10万, 为第三大常见肿瘤, 死亡率为24.70/10万, 低于肺癌, 居癌症相关死因的第二位.肝癌可分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝内胆管细胞癌、肝细胞-胆管细胞混合性癌和纤维板层样肝癌, 其中HCC占90%[2].由于缺少灵敏且特异度高的筛查及早期诊断方法, 超多半数的HCC患者在初次确诊时已处于中晚期, 预后不佳.miRNA是基因转录后表达的重要调控因子, 可在HCC发生早期即稳定表达于外周循环, 参与调控HCC细胞增殖和分化、凋亡、侵袭和转移[3,4].研究证实miR-888-5p为致癌miRNA, 广泛参与调节HCC的发生及进展[5,6].目前尚无HCC与血清miR-888-5p的相关报道, 本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)法检测HCC、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者以及健康人群血清中miR-888-5p的表达水平, 观察不同人群之间其表达量是否存在统计学差异, 探讨其表达水平与HCC患者临床特征之间的关系, 寻求一种无创、便捷、可重复性高的血清学诊断及预后相关分子生物指标.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 纳入与排除标准： (1)HCC患者： ①影像学或肝穿活检病理初次确诊的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关HCC患者; ②未接受手术、放化疗、靶向药物治疗等肿瘤相关治疗; ③无肺、心、脑、肾等重要脏器功能不全; ④无同时合并其他部位恶性肿瘤; ⑤无重大精神疾患者; (2)LC患者： ①腹部B超、CT等证实的HBV相关LC者; ②无恶性肿瘤病史; ③无肺、心、脑、肾等重要脏器功能不全; (3)CHB患者： ①乙肝两对半、腹部B超等诊断明确者; ②无恶性肿瘤病史; ③无肺、心、脑、肾等器官功能不全; (4)健康对照组： ①无其他系统癌症病史; ②无肺、心、脑、肾等重要脏器功能不全; ③无重大精神疾患者.本实验符合国家医学伦理学标准, 经我院伦理审查委员会审查并批准, 所有待检者于实验开始前已知情同意并签字.

1.1.2 一般材料： 血清/血浆miRNA提取试剂盒(美杰生物科技有限公司, 广州); PrimeScript RT reagent Kit(perfect Real Time)试剂盒(瑞真生物技术有限公司, 广州); TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus); qPCR试剂Ⅱ(瑞真生物技术有限公司, 广州); 茎环法miRNA qRT-PCR引物(锐博生物科技有限公司, 广州); 以秀丽隐线虫miR-39-3p作为外参, 由上海生生物工程有限公司合成(序列： UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG).

1.1.3 临床样本的收集与处理： 选取2019-04/2019-11南方医科大学珠江医院消化内科、肿瘤科及肝胆科住院首次确诊的HCC患者共68例, CHB46例, LC43例及同期健康体检者40例.受试者的一般资料见表1, 各组年龄及性别构成比均无统计学差异(P＞0.05).受试者禁食8 h后用静脉采血专用真空试管采集5 mL外周静脉血, 室温下3000 r/min离心15 min后分离血清, 然后将血清在4 ℃,17000g离心10 min, 吸取上清液作为检测样品,将其分装至1.5 mL无酶管, 保存至-80 ℃冰箱备用.

1.2 方法

1.2.2 qRT-PCR检测miR-888-5p表达水平： 应用BIORAD qRT-PCR仪, 按照试剂盒说明书, 反应体系20 μL：cDNA 4 μL, SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL, PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL, PCR Reverse Primer 0.8 μL (10 μmol/L), Rnase-Free Water 4.4 μL.qRT-PCR反应条件(两步法)： 预变性95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s, 共40个循环; 溶解曲线： 95 ℃ 1 min, 65 ℃ 5 s, 95 ℃ 5 min; 实验设置3个复孔, 取其平均值, 记录循环荧光阈值(cyclic threshold, CT).miR-888-5p组间相对表达量以2-△△CT表示, △△CT = mean(实验组目的基因CT值-实验组外参CT值)-mean(对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值)[7].

统计学处理基于预实验, 采用公式n= Ψ2(∑(Si2)/K)/[∑(Xi均-X均)2/(K-1)]计算得出每组实验对象至少40例.运用SPSS 20.0统计分析软件, 计量资料以P50[P25, P75]表示, 计数资料以频数及率表示, 组间比较采用非参数秩和检验,P＜0.05表示有统计学差异.受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评估诊断效能.

2 结果

2.1 miR-888-5p的qRT-PCR结果 采用2-△△CT法计算血清miR-888-5p相对表达量, HCC患者血清miR-888-5p最高表达量为62.90, 最低为0.34; LC患者中表达量最高为26.08, 最低为0.11; CHB患者miR-888-5p最高表达量为52.52, 最低为0.02; 健康对照最高表达量为27.95, 最低则为0.03.HCC组血清miR-888-5p表达量明显高于LC组、CHB组及健康对照组(P＜0.01), 差异有统计学意义; 而LC、CHB及健康对照组三组之间比较, 无显著统计学差异(P＞0.05)(图1).

2.2 血清miR-888-5p、AFP及其联合检测对HCC诊断价值 血清miR-888-5p对于诊断HCC的ROC曲线下面积(area under curve, AUC)为0.737(95%CI： 0.643-0.817; 敏感性： 79.41%, 特异性： 62.50%), AFP的AUC为0.819(95%CI： 0.734-0.887; 敏感性： 73.53%,特异性：97.50%), 联合两者检测AUC为0.907(95%CI： 0.835-0.954; 敏感性： 91.18%, 特异性： 72.50%).miR-888-5p诊断HCC具有较高的AUC及敏感性, 与AFP联合检测AUC及敏感性均得以提高, 可获得更高诊断价值(图2、表2).

2.3 miR-888-5p对于AFP阴性HCC患者的诊断价值 以AFP20 μg/L为界将68例HCC患者分为AFP阳性及AFP阴性HCC两组.对22例AFP阴性患者绘制ROC曲线所得AUC为0.793(95%CI： 0.671-0.885; 敏感性： 90.90%, 特异性： 62.50%), miR-888-5p对AFP阴性HCC患者具备良好的诊断效能(图3).

2.4 HCC患者血清miR-888-5p的表达和临床特征之间的关系 HCC血清miR-888-5p的表达水平与患者的性别、年龄、AFP、LC、Child分级、肿瘤直径、肿瘤数目、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、TNM分级及巴塞罗那分期均无明显相关性(P＞0.05), 而与肺转移相关(P= 0.01)(表3).

3 讨论

文献报道[8], 中国聚集着全球55%的肝癌病例, 每年平均约有38.3万人死于肝癌, 肝癌死亡病例占全球肝癌死亡总人数的51%.由于HCC具有高度异质性、进展迅速、侵袭度高、易转移等恶性生物学行为及早期临床症状隐匿、现有筛查诊断方法敏感性与特异性不足, 多数患者失去早期手术根治良机, 手术切除率仅为10%-20%左右, 高达70%的患者于手术后5年内复发, 其中2/3复发于术后2年内, 5年总体生存率仅为7%-10%[9].早在20世纪末, WHO提出了癌症的“3个1/3”相关策略, 目前看来, 优化HCC筛查方法提高HCC早期检出率, 是改善预后, 降低死亡率最有效、最根本的策略.

表1 研究对象的一般资料

表2 血清miR-888-5p、甲胎蛋白及两者联合检测对肝细胞癌的诊断价值比较

图1 各组血清样品中miR-888-5p相对表达水平散点图.肝细胞癌与肝硬化及健康对照组相比, aP ＜0.001; 肝细胞癌与慢性乙型病毒性肝炎相比, bP ＜0.01.HCC: 肝细胞癌; CHB: 慢性乙型病毒性肝炎; LC: 肝硬化.

图2 受试者工作特征曲线显示血清miR-888-5p、甲胎蛋白及两者联合检测对肝细胞癌的诊断价值.AUC: 曲线下面积; AFP: 甲胎蛋白; combine: 联合检测甲胎蛋白与miR-888-5p.

miRNA为真核细胞内高度保守长度约为21-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA, 通过与靶基因的3’端非翻译区进行完全性或不完全互补结合, 引起靶mRNA降解或者抑制翻译, 靶基因转录后表达水平改变, 广泛调控细胞生长、分化、凋亡及细胞信号转导等生命活动, 其表达失调与恶性肿瘤等多种疾病密切相关[10,11].据文献报道[12], miRNA可在HCC进程中扮演着抑癌基因和癌基因的重要角色.Murakami等[13]首次报道了miRNA在HCC中的异常表达模式, 认为miRNA表达异常是HCC发生、进展的共同生物学征.愈来愈多的研究证实[14-17], 循环miRNA可长期稳定存在, 不被内源性RNA酶降解, 亦能耐受极端酸碱环境及温度, 以上特性为我们的研究奠定了实验可行性的基础.

1) 舒适度。中国船级社(China Classification Society, CCS)在国际海事组织(International Maritime Organization, IMO)SOLAS修正案决议的基础上制定了“舒适度附加标志”的细则，包括COMF(NOISE N)噪声舒适性附加标志和COMF(VIB N)振动舒适性附加标志,N为舒适度等级1，2，3，其中：1表示舒适度最高等级；3表示可接受舒适度等级。由此可看出，船级社在随着航运发展的变革,逐步将客滚船舒适度要求标准化、具体化、规范化。

miR-888-5p是miR-888基因家族成员之一[18], 在HCC中发挥致癌作用.本研究采用qRT-PCR法检测, 相对定量法分析血清中miR-888-5p表达水平, 结果表明HCC患者血清中miR-888-5p表达量较CHB、LC及对照组显著升高(P＜0.05).进一步绘制ROC曲线分析发现, 血清miR-888-5p诊断HCC的AUC为0.7379(敏感性为79.41%, 特异性为62.50%), AFP的AUC则为0.819(敏感性73.53%、特异度97.50%); 而联合两者检测AUC高达0.907, 灵敏度高达91.18%, 特异性为72.50%.miR-888-5p对HCC诊断的灵敏度较AFP高, 而AFP则具有较高特异性, 联合检测两者的诊断效能及敏感性更高, 更具临床诊断价值.以AFP = 20 μg/L为分界, 将68例HCC分为AFP阳性组(46例)及AFP阴性(22例)两组, 分析miR-888-5p对于AFP阴性HCC患者的诊断价值, 所得AUC为0.793, 敏感性90.90%, 特异性62.50%, 可见miR-888-5p对AFP阴性HCC患者具有较高的敏感性及诊断效能, 且miR-888-5p表达水平与AFP无明显相关性(P= 0.08), 其有望成为AFP阴性HCC患者补充诊断的分子指标, 但仍需后续多中心、大样本实验进一步加以验证.

表3 血清miR-888-5p与肝细胞癌临床特征之间的关系

图3 miR-888-5p对甲胎蛋白阴性肝细胞癌患者的受试者工作特征曲线.AFP: 甲胎蛋白; HCC: 肝细胞癌; AUC: 曲线下面积.

miR-888-5p在人类常见多种肿瘤中发挥类似原癌基因的生物学作用[19-21].在HCC中, 其可上调癌细胞MMP-2和MMP-9表达水平, 抑制p53抑癌基因的表达,促进癌细胞迁移和侵袭[5].Li等[6]研究提示miR-888-5p可通过靶向抑制Smad4, 促进HCC细胞迁移和侵袭, 新发现的miR-888/Smad4轴为研究HCC的进展提供了新思路, 并提供了一个潜在的治疗靶点.我们通过分析发现HCC患者血清miR-888-5p的表达水平与患者的性别、年龄、AFP、LC、Child分级、肿瘤大小、肿瘤数目、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、TNM分级及巴塞罗那分期无明显相关(P＞0.05), 而与肺部转移相关(P= 0.01), 说明miR-888-5p可能参与调控HCC浸润及转移等生物分子机制, 且血清miR-888-5P不受患者性别年龄等因素干扰, 能够客观提示HCC细胞转移情况.我国学者黄湘俊等[22]研究结果显示miR-888-5p在HCC组织中表达高于癌旁组织, 且HCC分期分级越高, 其相应的表达水平越高, 说明其与HCC患者高度侵袭能力密不可分, miR-888-5p高表达可能是HCC浸润转移的重要步骤.然而该实验标本为手术切除所得, 组织标本取材复杂、有创、耗时、费力, 我们通过探究HCC患者血清miR-888-5p水平得出了一致的结论, 提示血清miR-888-5p有望替代组织细胞学miRNA的检测, 成为一种新型、无损、可重复性高、可全面实时监测的HCC预后相关肿瘤分子标志物, 用于指导后续临床工作.

文章亮点

实验背景

肝癌是我国常见的消化系统高度异质恶性实体瘤, 临床症状不典型、进展快、易转移, 现有血清学筛查手段缺乏灵敏度及特异性, 早期诊断率低下, 导致高死亡率, 预后极差的严峻局面.miRNA是一类广泛调控基因转录后表达的调控因子, 其结构简单、不转录、不被加工后修饰, 具有时序性、组织细胞特异性, 并可于肿瘤发病早期稳定表达于外周循环, 可帮助鉴别肿瘤起源组织, 且与肿瘤临床病理类型相关.近年来, 相关文献报道miR-888-5p在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织及细胞中高表达, 发挥致癌作用, 然而HCC患者血清中miR-888-5p表达水平及其作为HCC循环肿瘤分子标志物的价值仍未被探讨.

实验动机

目前国内外研究大多聚焦于miR-888-5p与HCC组织细胞的基础研究, 本实验通过检测HCC患者、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者、肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者及健康人四组受试者血清中miR-888-5p表达水平, 评价其用于HCC早期诊断、病情评估及预后判断的临床应用价值.

实验目标

本研究通过收集临床血清学样品, 检测血清miR-888-5p表达水平, 比较HCC患者与对照组之间其表达水平是否存在差异, 进一步绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评价血清miR-888-5p对于HCC诊断的价值, 并分析了血清miR-888-5p与HCC患者临床病理特征之间的关系, 旨在验证血清miR-888-5p可否成为一种灵敏、特异、无损且实用价值高的循环肿瘤分子标志物.

实验方法

按照纳入排除标准收集68例HCC患者、46例CHB患者、43例LC患者以及40例同期健康体检者, qRT-PCR相对定量法检测血清中miR-888-5p表达量, 2-△△CT法计算组间miR-888-5p相对表达水平, 组间数据差异性比较采用秩和检验, ROC曲线评估miR-888-5p用于诊断HCC的价值, 同时分析miR-888-5p与HCC临床特征之间的关系.

实验结果

本研究发现HCC患者血清miR-888-5p显著高表达, miR-888-5p对于诊断HCC具有良好的诊断价值, 且对甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)阴性HCC患者具有辅助诊断价值, 联合检测miR-888-5p与AFP诊断价值更高.此外miR-888-5p与HCC远处转移密切相关, 但仍需后续动态监测miR-888-5p水平, 长期随访以证实miR-888-5p与预后之间的关系.

实验结论

本研究首次检测了HCC患者血清miR-888-5p表达水平,miR-888-5p对于HCC患者及AFP阴性HCC患者具有临床诊断价值, 且可提示预后, 有望成为HCC肿瘤特异性循环分子标志物.

展望前景

由于本研究为单中心研究, 样本量有限, 数据来源单一,未检测HCC治疗前后血清miR-888-5p的动态变化, 以及同时期HCC患者组织及细胞中miR-888-5p表达水平; 未根据HCC相关病因详细分组分析血清miR-888-5p对不同病因所致HCC的临床应用价值, 因此仍需日后进行多中心、大样本、更深入的研究.