柴胡皂苷d对自身免疫性肝炎小鼠差异表达基因CTLA-4、IL-10和IL-17的影响

郝健亨，陈 浩，高 艳，徐慧超，高玉亭，苗宇船，郝慧琴，刘 杨

山西中医药大学基础医学院， 晋中 030619

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏实质炎症，以不同程度的血清转氨酶升高、自身抗体阳性以及高γ-球蛋白血症为主要临床特征，组织学检查可见界面性肝炎，伴有大量浆细胞、淋巴细胞浸润[1]。该病多发于女性，且患病率存在显著的地域差异，在欧美发达国家发病率较高。当前中国仍缺乏确切的AIH流行病学数据，但国内与AIH相关的文献报道数量有明显升高趋势[2]。目前，已知环境因素、遗传因素和饮食习惯与AIH的发病密切相关，但其确切的触发因素与发展的潜在机制尚未完全阐明[3]。当前，对AIH的治疗主要是依靠免疫抑制药物和皮质类固醇药，但这些方法有诸多不良反应，抗原特异性的免疫调控细胞回输将可能发展成为治疗AIH 最有价值的方法之一。柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SS-d）是从柴胡干燥根部提取分离出来的五环三萜类齐果烷型衍生物，具有多种药理学作用，例如抗炎、抗病毒、免疫调节和抗肝损害等[4-5]。本研究拟采用静脉注射刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）的方法建立AIH小鼠模型，并采用 Agilent-085631芯片对AIH相关的差异表达基因进行筛选，同时观察SS-d对部分差异表达基因的影响，进而对AIH的发病机制以及SS-d对AIH的治疗机制进行探讨，为临床上应用SS-d治疗AIH提供实验室依据。瑞公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

1.1.1 实验动物 健康、SPF级的C57BL/6小鼠40只，鼠龄 9～10周，体质量（20±2） g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2016-0006。将小鼠随机分为芯片组（n=8）和SS-d治疗机制组（n=32）。将芯片组随机分为正常组和模型组（每组n=4）；SS-d治疗机制组随机分为正常组、模型组、SS-d低剂量组和SS-d高剂量组（每组n=8）。小鼠常规饲养，自由摄食，饲养温度为22～25 ℃，湿度为58%左右，通风良好。

1.1.2 主要实验试剂 Agilent-085631芯片（欧易生物医学科技有限公司，中国上海），SS-d、ConA（索莱宝科技有限公司，中国北京），兔抗CTLA-4多克隆抗体（爱博泰克生物科技有限公司，中国武汉），兔抗GAPDH多克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP （博士德生物工程有限公司，中国武汉），RT Master Mix （宝日医生物技术有限公司，中国北京），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞生物科技有限公司，中国南京）。CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA以及mGAPDHmRNA由武汉金开

1.2 实验方法

1.2.1 AIH小鼠的模型建立及分组处理 ①基因芯片组：正常组常规饲养，模型组小鼠按15 mg/kg的剂量给予尾静脉注射Con A；12 h后处死并提取肝组织，按Agilent-085631芯片说明书进行差异表达基因的筛选。②SS-d治疗机制组：正常组常规饲养；模型组按15 mg/kg剂量给予尾静脉注射Con A；SS-d低剂量组和SS-d高剂量组根据相关文献[6-7]和前期预实验结果分别按2.5和5.0 mg/kg剂量腹腔注射SS-d，8 h后按15 mg/kg剂量给予尾静脉注射Con A。各组小鼠于造模12 h后，先通过眶内取血法收集小鼠血液并制备血清，后采用颈椎脱臼法处死全部小鼠，取出肝脏后经液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 筛选基因芯片组小鼠差异表达基因 提取小鼠肝组织总RNA，按照芯片标准流程进行样本总RNA的定量、完整性检测、标记，芯片的杂交、洗脱，数据的扫描、收集、整理等步骤。采用Feature Extraction软件处理原始图像，提取原始数据，利用GeneSpring GX软件对原始数据进行“Quantile”标准化。过滤标准化后的数据，且用于比较的每组样本中至少有1组75%的样本标记为“Detected”的探针留存，进行后续分析。利用T检验的倍数变化值与P值对差异基因进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。对差异基因进行KEGG富集分析，并以此判定差异基因主要影响的信号转导通路。最后，用qRT-PCR技术对部分差异表达基因CTLA-4、IL-10、IL-17进行验证。根据反转录试剂盒说明书要求，将相关试剂与10 μL总RNA均匀混合（总体积为20 μL），进行反转录。反应条件：37 ℃×15 min，1次循环；85 ℃×5 s，1次循环（4 ℃冰箱保存反转录产物）。用real-time PCR 试剂盒相关试剂与2 μL反转录产物混合均匀（总体积为20 μL），进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ ×30 s，1次循环；95 ℃ ×5 s，60 ℃ ×34 s，40个循环。根据real-time PCR原始检测结果，采用2-△△CT相对定量计算公式计算出各样品目的基因的相对表达量。

1.2.3 苏木精 - 伊红（H-E）染色观察SS-d治疗机制组小鼠肝脏炎症反应程度 将SS-d治疗组一部分小鼠肝组织经4%多聚甲醛固定24 h后，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，RM2235型石蜡切片机切片（片厚5 μm），常规H-E染色；用中性树胶固封，并在光学显微镜下观察各实验组小鼠肝脏炎症反应程度。

1.2.4 微板法检测SS-d治疗机制组小鼠血清谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）含量 根据试剂盒说明书要求，采用微板法，通过SpectraMax Plus384酶标仪测定各实验组小鼠血清GPT和GOT含量（U/L）。

1.2.5 荧光定量PCR技术检测SS-d治疗机制组小鼠肝 组 织CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA表达 取各实验组小鼠肝组织50 mg，通过酚 - 氯仿法提取总RNA。根据反转录试剂盒说明书要求，将相关试剂与10 μL总RNA均匀混合（总体积为20 μL），进行反转录。反应条件：37 ℃×15 min，1个循环；85 ℃×5 s，1个循环（4 ℃冰箱保存反转录产物）。用real-time PCR 试剂盒相关试剂与2 μL反转录产物混合均匀（总体积为20 μL），进行PCR扩增，反应条件：95 ℃×30 s，1次循环；95 ℃×5 s，60 ℃×34 s，40个循环。根据real-time PCR原始检测结果，采用2-△△CT相对定量计算公式计算出各样品目的基因的相对表达量。

1.2.6 ELISA技术检测SS-d治疗机制组小鼠血清IL-10、IL-17含量变化 根据各ELISA试剂盒说明书要求，通过SpectraMax Plus384酶标仪检测各实验组小鼠血清IL-10和IL-17吸光度值，并根据标准曲线计算上述指标的含量（pg/L）。

1.2.7 Western blotting检测SS-d治疗机制组小鼠肝组织细胞毒T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen，CTLA） -4蛋白的表达变化 常规提取肝组织总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。配10%胶后放入电泳槽中，分别加入蛋白样品15 μL，接通电源先以80 V、40 min进行电泳，后改为120 V跑至胶底部停止，用湿法转将蛋白转至PVDF膜，转运时长2 h。取出膜放入脱脂奶粉（浓度5%）封闭2 h，把两张膜分别放入CTLA-4一抗（浓度1:400）与GAPDH一抗（浓度1:500）4 ℃孵育过夜；TBST洗膜5×5 min后，羊抗兔IgG-HRP二抗（浓度1:500）室温摇床孵育1 h；TBST洗膜5×5 min后滴加显影剂，通过c300化学发光成像系统扫描显影，并利用ImageJ软件分析。

1.3 统计学分析

应用 SPSS 25. 0 统计软件进行实验数据的统计与分析，所得数据以x—±s表示，采用单因素方差分析法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芯片组小鼠差异表达基因的筛选

芯片组小鼠共筛查差异表达基因11 512个，其中表达上调5 189个，下调6 323个。注释到KEGG pathway基因共计1 567个，P≤0.05的信号通路共计138条（P值最小的前30条信号通路的气泡图见图1）；表达上调基因5 189个，注释到KEGG pathway基因共计781个，P≤0.05的信号通路共计102条（P值最小的前30条信号通路的气泡图见图1）；表达下调基因6 323个，注释到KEGG pathway基因共计789个，P≤0.05的信号通路共计77条。qRT-PCR对部分差异表达基因的验证结果显示，CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA的含量变化趋势与芯片筛选结果一致（图2）。

图1 芯片组小鼠差异表达基因的KEGG富集分析结果Fig 1 KEGG enrichment analysis results of differentially expressed genes in chip group

图2 差异表达基因的qRT-PCR验证结果Fig 2 Results of qRT-PCR verification of differentially expressed genes

图3 SS-d治疗机制组小鼠肝脏H-E染色结果Fig 3 Results of H-E staining of liver in SS-d treatment group

2.2 SS-d治疗机制组小鼠肝脏炎症反应程度

正常组小鼠肝细胞正常，肝小叶结构完整清晰，肝索排列有序整齐；模型组可见肝细胞肿胀、变性、坏死，并伴有大量炎症细胞浸润；与模型组比较，SS-d低剂量组小鼠肝组织内淋巴细胞浸润减轻，肝细胞坏死程度降低；SS-d高剂量组病理变化改善更为明显（图3）。

2.3 SS-d治疗机制组小鼠血清GPT和GOT的含量变化

与正常组比较，模型组血清中 GPT和GOT显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，SS-d高剂量组GPT、GOT显著降低（P＜0.05）；SS-d高剂量组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；SS-d低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

图4 SS-d治疗机制组小鼠血清GPT和GOT含量变化Fig 4 Serum GPT and GOT levels in SS-d treatment group

2.4 SS-d治疗机制组小鼠肝组织 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表达变化

正常组小鼠肝组织中CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表达量最高，IL-17mRNA表达量最低；模型组与正常组比较，CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表达量显著降低，IL-17mRNA表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；但SS-d高剂量组与正常组比较，表达差异无统计学意义（P＞0.05）；相比于模型组，2个治疗组CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表达量均有不同程度的升高，而IL-17mRNA表达量均有不同程度的降低，其中SS-d高剂量组与模型组的差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图5 SS-d治疗机制组小鼠肝组织 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表达量的变化Fig 5 Changes of CTLA-4, IL-10 and IL-17 mRNA in liver tissues of mice in SS-d treatment group

2.5 SS-d治疗机制组小鼠血清IL-10和IL-17含量的变化

与正常组比较，AIH模型组血清中 IL-17含量显著升高（P＜0.05），IL-10含量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，SS-d高剂量组IL-17含量显著降低（P＜0.05），而IL-10含量显著升高（P＜0.05）；SS-d高剂量组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；SS-d低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图6）。

图6 SS-d治疗机制组小鼠血清IL-10和IL-17含量的变化Fig 6 Changes of serum IL-10 and IL-17 levels in SS-d treatment group

2.6 SS-d治疗机制组小鼠肝组织CTLA-4蛋白的表达变化

与正常组小鼠比较，模型组小鼠肝组织CTLA-4蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组肝组织中CTLA-4蛋白表达量均有所增高（P＜0.05），SS-d高剂量组增高更为明显；但SS-d高剂量组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；SS-d低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图 7）。

图7 SS-d治疗机制组小鼠肝组织CTLA-4蛋白的表达变化Fig 7 Changes of CTLA-4 protein expression in liver tissues of mice in SS-d treatment group

3 讨论

AIH是一种免疫介导的进行性肝损伤，临床表现可以从轻度或重度症状发展成为肝衰竭。患者血清转氨酶水平升高，组织学上表现为界面肝炎和浆细胞的存在，血清学上表现为免疫球蛋白G水平升高。AIH可以影响任何年龄段人群，主要以中年女性居多，其发病率也因地域而异。当前AIH的发病机制尚不明确，有证据表明遗传和环境因素都与其有紧密关联；同时，外周自我耐受性破坏，FOXP3+调节性T细胞功能受损，以及效应细胞对组织水平抑制的抵抗在AIH免疫病理发生中起重要作用[3]。本实验结果表明，AIH的发病过程非常复杂，系多条信号通路的活性发生改变的共同作用结果。本次实验选用的是ConA诱导的小鼠肝损害模型，ConA作为一种植物血凝素，能有效刺激T细胞并迅速诱导T细胞的活化和浸润[8-11]。H-E染色结果显示，经尾静脉注射ConA后，AIH小鼠肝脏内门管区及肝小叶中央静脉可见大量淋巴细胞浸润，肝小叶内部分肝细胞变性、肿胀、坏死，同时伴有血清GPT和GOT的显著升高，均提示ConA可通过诱导淋巴细胞活化攻击自身肝组织，进而促进AIH的发生和发展。因此，本次实验选择T细胞受体信号转导通路以及Th17细胞分化信号通路的部分差异表达基因（CTLA-4、IL-10和IL-17）作为后续验证AIH发病机制以及SS-d治疗机制的靶点。

Th17细胞是代表T辅助淋巴细胞的特殊子集，不仅参与黏膜和上皮屏障的抗微生物免疫，而且还是肿瘤发生的关键细胞成分，参与肿瘤的发生和发展[12-13]。同时，Th17细胞是免疫应答的正调节因子。一方面，它能产生包括IL-17A、IL-17F和IL-22在内的多种促炎细胞因子，这些细胞因子的产生不仅促进免疫细胞（如中性粒细胞和淋巴细胞）在炎症部位的积累，而且还可以引起组织病理学改变[14]。另一方面，Th17细胞可有效促进Treg的扩增和表型稳定[15]。Th17细胞与AIH发病机制密切相关。有研究[16]证实：AIH患者的血清IL-17水平和肝内Th17细胞的频率显著高于健康对照者，并且AIH患者肝脏中IL-17+淋巴细胞浸润（主要表现为CD4+表型）明显增加，肝脏IL-17+细胞浸润程度与AIH患者的肝脏纤维化和炎症程度呈正相关；同时，IL-17也被证明通过肝细胞中的丝裂原活化蛋白激酶途径诱导IL-6表达。多种证据[17]表明，Th17细胞增殖是AIH发病的关键触发因素，Th17细胞与肝细胞之间的正反馈回路加剧炎症过程。Th17细胞特征在于IL-17大量产生，IL-17通过介导T细胞和炎症细胞在组织中的浸润，与干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子协同发挥作用，促进T细胞的活化，进而产生炎症性破坏并放大靶器官的免疫反应，参与AIH等多种免疫性疾病的发生和发展[18]。Th17细胞和IL-17信号通路在AIH的发病机制中有重要作用。Treg是免疫耐受和炎症反应的重要调节因子，主要通过下调机体的免疫应答维持自身耐受。一方面，它产生抗炎细胞因子如IL-10来抑制免疫反应；另一方面，它可以通过表达CTLA-4（在小鼠中具有从APC反式内吞CD80/CD86的能力），从而防止APC 激活和效应T细胞扩增[15]。同时，Treg还可以在体外和体内促进Th17细胞的分化，从而增强Th17细胞的功能性后果（对宿主防御的保护作用，以及对炎症和肿瘤生长的不利作用）。Treg细胞组成性地表达CTLA-4。CTLA-4是T细胞应答的重要负调节因子，主要通过下调T细胞活化维持机体组织器官的免疫耐受。CTLA-4的表达或功能异常参与AIH的发病过程。IL-10是一种具有强抗炎作用的细胞因子，在限制宿主对病原体的免疫反应，从而防止对宿主的损害和维持正常组织稳态方面发挥着核心作用。IL-10的失调与AIH发展风险的增加有关[19]。CTLA-4和IL-10作用机制类似[20]。研究[21]证实，IL-10的抑制作用与CTLA-4和B7分子结合发挥负向免疫调节作用有密切关系。

总之，IL-17、CTLA-4和IL-10三者都是调节免疫功能活性所必需的，与AIH的发病机制有紧密关联。本实验结果显示，相较于正常组，AIH模型组小鼠肝组织中CTLA-4蛋白表达水平显著降低，CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表达量明显下降，模型组血清中IL-10含量降低，表明CTLA-4和IL-10共同参与AIH在小鼠体内发病过程，即通过参与免疫反应的负调节来维持机体的免疫自稳。对比正常组，模型组血清中IL-17含量明显升高，IL-17 mRNA表达量增高。由此可推测，Th17和Treg的平衡可能与AIH发病有关，其中CTLA-4、IL-10和IL-17表达的变化在AIH发生和发展中起着关键的作用。

中药柴胡始载于《神农本草经》，主要入药部位在根部，有解郁疏肝、解表泄热、升阳气的作用，目前已广泛用于治疗亚洲国家的几种肝病。SS-d是从柴胡中提取的三萜皂苷，并被认为是从柴胡中分离出的各类柴胡皂苷中最活跃的一种，具有抗肿瘤、抗过敏、抗凋亡和免疫调节活性等多种药理学作用；此外，SS-d还具有明显的抗炎活性。在细胞因子水平上，SS-d能抑制促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-6等；同时，可以提高抗炎细胞因子的表达，如转化生长因子β1和IL-10等[22]。既往研究[23]表明，SS-d对T细胞有丝分裂原具有调节T细胞功能和抑制淋巴细胞增殖的作用。之后，有研究[24]表明，SS-d不仅能抑制OKT3/CD28共刺激的人T细胞增殖，而且在体外抑制PMA、PMA/Ionomycin和Con A诱导的小鼠T细胞活化，SS-d对PMA诱导的T细胞活化的抑制作用与通过抑制IKK和Akt活性而下调NF-κB信号有关。本次实验结果显示AIH模型组CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表达量最低，IL-17 mRNA表达量最高。相较于AIH模型组，SS-d低剂量组和SS-d高剂量组CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表达量随剂量加大有上升趋势，而IL-17 mRNA表达量则逐步下降；并且，H-E染色结果显示，2个治疗组小鼠肝组织炎症反应不同程度减轻，肝细胞坏死情况得到不同程度改善。相较于模型组，SS-d低剂量组和SS-d高剂量组CTLA-4蛋白表达水平随剂量加大逐步升高；并且对比模型组，治疗组中血清GPT、GOT和IL-17水平有不同程度降低，IL-10呈逐步升高趋势。以上结果说明SS-d治疗AIH的作用机制与CTLA-4、IL-10和IL-17的表达变化有关，它通过刺激肝细胞内CTLA-4和抑炎因子IL-10的表达，降低T细胞的活化程度，发挥免疫调节作用，并通过抑制促炎因子IL-17的表达降低炎症反应对肝脏的损害作用。

综上所述，在AIH早期，各种致病因素可以导致T细胞受体信号通路活性发生变化，引起T细胞的异常激活，从而诱发肝脏损害；而SS-d可通过调节T细胞受体信号转导通路以及Th17细胞分化信号通路中部分基因如IL-10、CTLA-4、IL-17的表达，抑制炎症反应对肝脏的损害，改善AIH小鼠肝功能。